拟南芥耐镉基因的鉴定和玉米韧皮部蛋白的提取(3)
1 材料与方法
1．1实验材料
1.1.1 酵母菌株与载体
酵母菌株：yod、Δycf1
载体及感受态：大肠杆菌E.coli DH5α、pMD19-T Vector
1.1.2 植物材料
玉米品种：农大108
选取颗粒饱满均一的种子泡在水中过夜，第二天均匀地铺在垫有软纸的白色瓷盘上，洒水使其处于湿润状态，置于温室暗处培养。约两昼夜后，待其处于萌芽状态，选取萌发状态，根长芽长较为一致的玉米种子置于培养箱中水培培养。待农大108长到三叶期后，用100 μM浓度的CdCl2处理24 h，然后用于下一步实验。
1．2仪器与试剂
DEC-810BS-196型PCR仪、恒温培养箱、TG16-W型台式高速离心机（湖湘仪），AllegraTM6R型水平离心机（Beckman）、水平摇床、HE-120水平电泳槽（上海天能科技有限公司），PowerPac3000电泳仪（Bio-rad）、SW-CJ-1FD型超净工作台（苏净集团安泰公司），DK-S26型水浴锅（上海精密实验设备有限公司）、SDS-PAGE垂直板状电泳系统。
TaKaRa LA Taq DNA聚合酶、GC buffer、dNTP、oligo（dT）、快切酶、DNA Marker，-Ura DO Supplement、-Leu DO Supplement、腺嘌呤sigma产品、Yeast Nitrogen Base W/O（YNB）、凝胶回收纯化试剂盒、质粒小量提取试剂盒。
1．3培养基
Leu单缺培养基、YPDA培养基、0.1mol/LCdCl2母液、50%PEG、 1M LiAc、10×TE sterile、玉米培养A液（Ca(NO3)2▪4H2O，KNO3配制）、玉米培养B液（KH2PO4，MgSO4▪4H2O配制）、玉米培养C液（H3BO3，MnSO4▪H2O，CuSO4▪5H2O，ZnSO4▪7H2O，Na2SO4▪2H2O配制）、玉米培养D液（EDTA▪2Na，FeSO4▪7H2O配制）。
1.4 实验方法
1.4.1 酵母感受态的制备与转化
（1）将保存的Δycf1菌在YPDA固体培养基上划线，在30℃培养箱中倒置培养；
（2）将长势好的单菌落在超净台内转接入5mLYPDA液体培养基中，30℃培养箱，200rpm，过夜培养；
（3）取过夜培养的菌液5µL转接到50mLYPDA液体中，30℃，200rpm在摇床中震荡培养16-20小时，摇至OD600=0.3-0.5。；
（4）将菌液于50mL离心管中离心，1000rpm，5min,去尽上清，将沉淀转移至100mL YPDA液体培养基中，30℃，200-250rpm 震荡培养3h左右，摇至OD600=0.4-0.5；
（5）离心，去上清，用无菌水重悬，1000rpm离心5min，收集菌体；
（6）每50mL菌液加入1.5mL TE/LiAc，转移至2mL离心管中后12000rpm 离心15s；
（7）去掉上清，加入600µL TE/LiAc溶液，即可得到酵母感受态细胞。
（8）转化：将1µL pGADT7空载或4µL文库质粒、5µL鲑鱼精DNA、50µL感受态细胞、300µL PEG/LiAc混合，放置在30℃培养箱中30min，期间每10min取出并轻轻摇匀；之后加入二甲基亚砜20µL，置于42℃水浴锅中热激20min，10min时混匀；取出放置在冰上冷却，然后12000rpm快速离心，弃上清，加入200µL 生理水或1xTE。
（9）将pGADT7空载或文库质粒均匀涂布于含CdCl2的缺Leu单缺培养基上，于30℃恒温培养箱中倒置培养，让其生长2-3天。
1.4.2 确定镉的浓度
将pGADT7空载转入Δycf1中，设置Cd离子的浓度为0、10、20、40、50、100µM，观察酵母生长状况。 CdCl2浓度为40µM时空载酵母不再生长，确定筛选浓度为CdCl2浓度40µM。
1.4.3 菌落PCR
菌落PCR体系：
Total 15 uL
2×Es Taq Mix 7.5 uL
上游引物 1 uL
下游引物 1 uL
ddH2O 5.5 uL