大豆耐旱候选基因GmND2的克隆与分析
毕业论文关键词：大豆；干旱胁迫；基因克隆
Cloning and Analysis of a Drought-Tolerant Candidate Gene GmND2in Soybean
Abstract： Drought is one of the main abiotic stresses that cause the decline of quality and yieldof soybean (Glycine max (L.) Merr.), which has brought huge economic losses to crops.Recent studies showed under drought stress, the responses of plants can effectively reduce thestress injury, and protect the cell structure integrity and stability, as well as improve thetolerance to the adverse environment. On the basis of the preliminary work in our laboratory,we cloned the soybean drought-tolerant candidate gene GmND2 from the leaves of twosoybean varieties (Meng-8206 and Linhe). The coding sequence (CDS) of this gene is 237 bpin length, encoding a polypeptide of 78 amino acids. Quantitative RT-PCR showed that therelative expression level of GmND2 changed under drought stress, moreover, there wasdifferential expression patterns in different drought tolerant varieties (Meng-8206 and Linhe).Our study found that, the relative expression of GmND2 in the drought-sensitive material(Linhe) showed down-regulated with the increase of drought treatment time, but up-regulatedin the drought-tolerant Meng 8206. Therefore, GmND2 gene may be involved in soybeanresponse to drought stress.Key words: Soybean; Drought stress; Gene cloning
目 录
摘要1
关键词1
Abstract…1
Key words1
引言1
1 材料与方法…2
1.1 实验材料及取样3
1.2 RNA 提取与 cDNA 第一链合成…3
1.2.1RNA 提取3
1.2.2cDNA 第一链合成…3
1.3 荧光定量 PCR…3
1.4 GmND2 基因的克隆4
1.4.1GmND2 基因 CDS 序列的克隆…4
1.4.2GmND2 基因启动子克隆…5
1.5 基因序列分析…6
2.结果与分析6
2.1 叶片相对含水量分析6
2.2 荧光定量结果分析… 6
2.3 GmND2 基因克隆及序列比对分析… 7
3.讨论… 9
3.1 启动子区域序列差异… 10
3.2 表观遗传学因素… 10
致谢…10
参考文献10
大豆为一年生豆科大豆属的作物，是一种富含碳水化合物、蛋白质、脂肪和淀粉的豆科植物，同时也是重要的油料作物及粮食作物，与食品、机械、轻工业、医学以及饲料等相关产业联系密切，与国民生活质量息息相关。我国是大豆的起源国，大豆栽培历史较为悠久。大豆在我国种植面积较大，过去一向是我国在国际市场上竞争力较强的农产品， 但在近些年来， 国外现代生物技术的迅猛发展使大豆生产格局发生了巨大的变化，我国大豆生产面临着严重的困境。自 1996 年起，我国大豆出口国的地位出现动摇，转变成为了大豆进口大国，并且进口量还呈现逐年上升的趋势[1],严重依赖国外供给。在此形势下，利用科技手段培育优质高抗高产的大豆新品种成为大豆育种的主要目标。干旱是影响农业发展的主要非生物胁迫之一，世界上有 1/3 的土地属于干旱或半干旱区域，其他地区周期性干旱也时有发生[2]。随着全球气候变化失衡，极端天气发生的概率大大增加，致使干旱持续时间更长、影响区域更广。干旱胁迫是植物体内水分损失，作物正常的生理代谢受到影响进而造成减产的一种作物逆境。由引起原因可分为大气干旱、土壤干旱。大气干旱是由高温和干热风引起空气湿度急剧下降，造成空气过度干燥所引起的干旱，土壤干旱则是由于土壤有效水含量较低而引起的干旱[3]。植物主要依靠根部吸收土壤中的水分，所以土壤干旱问题更为关键。大豆对水分亏缺非常敏感，据有关资料显示，每生成 1kg 的大豆干物质，需耗费水分 600 到 1000㎏[4]。干旱影响了植株的新陈代谢及生理生化进程，致使大豆的生长发育遭到抑制。严重的干旱胁迫会使得叶绿体结构变性和片层被破坏,引起叶绿体的活性降低,抑制大豆的光合作用,从而使得养分的运输与积累减少,对作物的产量形成带来不良影响[5]。植物在漫长的进化过程中，逐渐形成一系列有效的机制，保护自身结构和生理功能完整性，使自身免受非生物胁迫的伤害，这其中就包括调控胁迫相关基因的表达以应对不良环境。逆境胁迫诱导表达基因可大致分为两大类[6]，即功能蛋白编码基因和参与逆境胁迫信号转导过程的转录调控蛋白编码基因。现阶段，随着科研技术的不断提高，大豆与干旱之间的关系，从宏观表型到微观细胞基因，已进行了各项研究并取得了一定的成果，利用现代分子生物学技术能够从基因表达水平探究植物与耐旱之间的关系。周宁[7]等对野生大豆过氧化物歧化酶（SOD）基因的克隆和研究表明，通过转 SOD 基因可有效提高植物对干旱胁迫的耐受能力。2013 年，野生大豆中克隆出的 GsWRKY20 基因被证实具有降低气孔密度、减少大豆植株失水的功能，植株抗旱能力有所增加[8]，Calmes 等的研究[9]表明，脯氨酸的合成与耐旱性之间有所关联，与干旱胁迫信号传递有关的酶类，如磷脂酶基因的表达可被激素信号（如 ABA）和干旱胁迫等因素调节，在激素响应环境信号的过程中发挥重要作用[10]。随着研究的深入，许多与耐旱相关的基因逐步被挖掘出。应用分子生物学、分子遗传学等方法研究作物耐逆机制，寻找耐逆基因，并通过基因工程培育作物耐逆品种已成为当今作物育种研究的主要内容。植物可以通过调节 NADH（还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）介导的叶绿体呼吸电子传递或循环电子传递来文持其氧化还原系统的平衡，而 NADH 脱氢酶是催化电子传递的重要酶类。近几年来，与叶绿体信号传递以及植物抗逆作用相关的研究正在展开。已有研究证实叶绿体信号可能与植物的热胁迫以及干旱胁迫适应有关。杨建国[11]的研究表明在杨树中，干旱胁迫下 NDH（NADH 脱氢酶复合体）活性被促进，NADH 脱氢酶能够使叶绿体中活性氧的积累受到抑制，保护植物免受干旱胁迫的伤害。Wang P 的研究[12]表明，处于高温、水分胁迫等环境胁迫中的植物 NDH 蛋白的表达量增加，促进了NDH 介导的循环电子传递形成额外的跨膜质子梯度（ΔpH）以文持同化的进行，从而减轻环境胁迫对植物造成的伤害，说明它们与逆境胁迫抗性相关。本研究在实验室前期工作的基础上，选定一个耐旱候选基因 GmND2（ND2：NADH 脱氢酶亚单位 2（NADH dehydrogenase subunit 2））。选取有耐旱性差异的两份材料蒙8206 与临河大粉青，干旱胁迫 9d、13d、15d 后进行叶片取样。利用荧光定量PCR 分析耐旱候选基因 GmND2 的表达差异。然后分别从蒙 8206 和临河大粉青中克隆出 GmND2 基因，对基因编码区和启动子区的序列进行对比以及生物信息学分析，初步探索 GmND2 基因与大豆耐旱性之间的关系。1.材料与方法1.1 实验材料及取样大豆(Glycine max)品种临河大粉青和蒙 8206 由南京农业大学国家大豆改良中心种质资源研究室提供。材料利用沙土为基质， 遮光萌发 4d， 分装于花盆内 （花盆上口径 15cm， 下口径 13cm） 。材料种植于光照培养箱内，28℃（早 6 点），光照强度 50000LX，22℃（晚 8 点），0LX，保持光照培养箱内湿度为 60%。13d 后，试验组进行干旱胁迫，对照组正常浇水，干旱胁迫开始后光照培养箱内湿度为 50%。干旱胁迫 9d、13d、15d，分别收获试验材料。处理组：每盆每株收取植株第一片三出复叶中间小叶用来测叶片相对含水量(相对含水量计算公式为：（鲜重 Wf-干重 Wd）/（饱和鲜重 Wt-干重 Wd）×100%）。其中一份提取 RNA，另一份用作备用，利用液氮速冻材料，收于-80℃冰箱保存。对照组：每盆每株取第一叶，混合取样，用于提取 RNA。1.2 RNA 提取与 cDNA 第一链合成1.2.1 RNA 提取按照宝生物工程有限公司 RNAiso for polysaccharide-rich Plant Tissue 试剂盒方法提取叶片总 RNA，具体操作步骤如下：1..称量超低温冻结的RNA样品,快速将样品转移到用液氮预冷过的研钵里,用研磨棒研磨组织的同时加入液氮研磨,直到研磨成粉末状。2.向研钵中的 RNA 提取样品中加入一定量的 RNAiso plus,完全覆盖住磨成粉状的样品。随后将样品放在室温下静置,等到样品完全融化,再用研磨棒继续研磨,直到裂解液呈现透明状。3.向呈现透明状的裂解液中加入氯仿,体积为 RNAiso plus 的 1/5。盖紧离心管后用手剧烈震荡数十秒,待溶液充分乳化,即没有分层现象后,再放置于室温下,静置 5min。4.将上述离心管 12000g 4℃离心 15min。5.从离心机中取出离心管,此时匀浆液分为三层,上清液为无色、 中间是白色蛋白层,底部为有色的有机相,将上清液吸取出转移至另一新的离心管中(留意不可将中间的白色部分吸出)。6.把等体积的异丙醇加入到上清液中,上下颠倒充分混匀后在15℃至 30℃下静置10min。7.12000g 4℃离心 10min,离心后试管底部出现沉淀。8.用移液枪吸出上清液，保留底部沉淀，沿离心管壁缓慢加入 1ml75%的乙醇（不要触及沉淀）。缓慢上下颠倒洗涤离心管壁，12000g 4℃离心 5min后弃去乙醇（应尽量将乙醇除尽）。9.室温下将沉淀干燥 2-5min，加入适量的 RNase Free 水缓慢溶解沉淀，若想提高溶解速率可用移液枪吹打沉淀，等 RNA 沉淀完全溶解后将其置于-80℃冰箱保存。1.2.2 cDNA 第一链合成用 TaKaRa生物公司的 cDNA 第一链合成试剂盒合成 cDNA，反转录后的 cDNA 用于基因的克隆与荧光定量 PCR 反应[13]。