草莓DELLA蛋白的分析与克隆鉴定(3)
虽然在拟南芥等模式植物中DELLA的研究已经较为透彻，但在草莓中的研究较少，对赤霉素调控草莓株型的分子机理尚不是很清楚。研究草莓DELLA蛋白可以了解赤霉素调控草莓生长的分子机理，为培育出更好株型的草莓品种提供理论指导。同时，作为蔷薇的模式植物，研究森林草莓DELLA蛋白的功能，有助于进一步了解其他蔷薇科果树如苹果、梨、李、桃等中DELLA蛋白功能，进而解析这些植物中GA的作用机理，以达到改良果树株型、提高水果产量和品质的目的。
本研究以森林草莓为材料，从森林草莓基因组中鉴定到2个编码DELLA蛋白的基因，并对其进行了进化与表达分析，为了研究其生物学功能，我们提取了森林草莓的cDNA，利用基因特异性引物扩增到了这两个基因的全长，并构建了这两个基因的过量表达载体，为下一步的功能验证奠定了坚实的基础。
1 材料与方法
1.1材料
供试材料为本实验室保存的森林草莓( Fragaria vesca )。取森林草莓的叶片、匍匐茎、幼根、成熟的果实和未成熟的果实，用锡纸包裹后，液氮速冻，用于提取总的RNA，反转录合成cDNA和克隆DELLA蛋白编码的基因。
仪器与耗材：研钵、无RNA酶的离心管和枪头、移液枪、离心机、水浴锅、琼脂糖凝胶电泳仪、荧光成像系统等仪器。
试剂：实验用Plant Total RNA Isolation Kit Plus试剂盒购自成都福际生物技术有限公司，RT-PCR反转录试剂盒(PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA eraser，TaKaRa，Dalian，China)、rTaq酶、dNTP Mixture、10×PCR buffer均购自TaKaRa试剂公司(Dalian，China)，凝胶回收E.Z.N.A.®Gel Extraction Kit试剂盒购自上海伟进生物科技有限公司，Trans5α Chemically Competent Cell试剂盒购自北京全式金生物技术(TransGen Biotec)有限公司以及DEPC处理过的无菌双蒸水。
1.2 方法
1.2.1基因序列分析 DELLA蛋白为GRAS基因家族的成员，因此，我们首先根据GRAS domain(PF03514)结构域，从森林草莓基因组中筛选出所有的GRAS基因家族成员，然后再将这些基因与拟南芥、番茄的DELLA蛋白序列一起构建进化树，筛选出森林草莓中与拟南芥、番茄DELLA蛋白序列相似度最高的基因即为森林草莓DELLA蛋白编码基因，其基因编号分别为：Fv06210和Fv30958。
1.2.2基因表达分析 在网站http://bioinformatics.towson.edu/strawberry/newpage/Fruit_Specific_Genes.aspx搜索下载2个草莓DELLA蛋白编码基因Fv06210和Fv30958的表达数据，芯片基因表达数据经标准化处理(log2)，应用 MeV 软件绘制森林草莓在叶片、幼苗以及果实发育前期不同部位的基因表达热图(Heat map) 。
1.2.3总RNA的提取和cDNA的合成 参照Plant Total RNA Isolation Kit Plus试剂盒试剂盒说明书进行草莓叶片、匍匐茎、幼根、成熟和未成熟的果实的总RNA的提取，使用质量浓度为12 g•L－1的琼脂糖凝胶电泳仪检测RNA的质量。按照RT-PCR反转录试剂盒说明书将提取的总RNA反转录为cDNA。
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