1  材料与方法
1.1  植物材料与生化试剂
    本研究所取植物材料:4种不结球白菜雄性不育系材料2016-LBC-025、2016-LBC-028-4、2016-LBC-E017-4、2016-LBC-E022-13和共有保持系‘苏州青’均取材于由南京农业大学园艺学院白菜课题组的江浦农场试验区。
生化试剂:Mix酶、PMD-19-T Vector、Solution I、Trans1-T1 Phage Resistant化学感受态细胞以及DNA提取和回收试剂盒购于Takara公司。PCR过程中所需特异引物来自金斯瑞生物科技有限公司。
1.2  花器官的形态学观察比较
     随机选取不结球白菜4种雄性不育系材料2016-LBC-025、2016-LBC-028-4、2016-LBC-E017-4、2016-LBC-E022-13盛花期的花朵,观察其花器官形态特征,尤其关注其雄蕊的发育状况。
1.3  植物材料DNA制备
采用植物基因组DNA提取试剂盒进行DNA的制备,提取2016-LBC-025、2016-LBC-028-4、2016-LBC-E017-4、2016-LBC-E022-13及共有保持系‘苏州青’共5个样品的DNA。
取适量的植物新鲜组织,一般取约0.2~0.3 g,加入液氮进行充分研磨;将研磨好的粉末迅速加入到已混入0.1%巯基乙醇的700μL 65 ℃预热缓冲液GP1中,迅速颠倒混匀后65 ℃水浴20 min,此过程可多次颠倒离心管使样品充分混匀;加入700 μL 氯仿,充分混合均匀后12000 rmp 离心5 min;吸取上层水相加入到一个新的干净离心管中,加700 μL缓冲液GP2,振荡混匀;再将液体转入已放入收集管中的吸附柱CB3中,离心30 s,弃掉废液(若溶液体积过大,离心过程可分次进行);加入500 μL GD到吸附柱中再次离心30 s,倒掉废液后向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液PW(提前加入无水乙醇),12000 rmp离心30 s,倒掉废液;漂洗过程重复一次;将吸附柱CB3放回收集管,空转离心2 min,以尽量除去无水乙醇;吸附柱CB3室温中放置5-10 min,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液;再转入新的干净离心管,将50-200 μL洗脱缓冲液TE悬空滴加到吸附膜中间部位,室温放置2-5 min后离心2 min,收集离心管中溶液。提取的DNA样品检测纯度后保存在-20℃条件下。
1.4  特异引物设计
根据已有文献中发布的Ogura CMS、Polima CMS不育相关基因分别是orf138、orf224[1][12],确定两组引物序列如下,orf138P1:5’-TGGTCAACTCATCAGGCTC-3’;orf138P2:5’-GCCTCTAGGAGTAGTGAAGAAC-3’。orf224P3:5’-GCCTCAACTG-
-GATAAATTC-3’;orf224 P4:5’-CAAGGATCTCGTTCACCT-3’。
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