过量铜及甲基紫精对MSR的表达调控研究(2)
1 MSRs蛋白还原MetSO机制
MSR蛋白在细菌、酵母或哺乳动物细胞耐受胁迫或衰老的过程中发挥其基础功能。在酵母菌中，MSRA基因的缺失或过表达会分别导致酵母菌生存能力的降低或上升。不同于MSRA基因，MSRB基因的缺失对酵母菌寿命影响并不明显，但是，MSRA和MSRB的双缺陷株在生存能力上显著弱于MSRA缺陷株，这表明MSRA和MSRB这两类基因都非常重要[6]。在哺乳动物细胞中，MSR基因的丰度随着机体的衰老和疾病而下降。MSRA基因的表达随着环境的变化而调整，这一现象表明它参与到了机体抵抗氧胁迫的活动中。此外，人类线粒体上MSRB基因的过表达已被证实会保护急性淋巴白血病细胞免受蛋白损伤，同时也可以细胞在氧胁迫下的生存能力。以上研究表明MSR基因是保护机体在疾病和衰老情况下免受氧胁迫伤害的关键组份。
重金属是指元素密度在5.0 g/cm3以上的金属，包括Hg、Cd、Cu、Pb、Zn、Cr、Ni、Fe、Co、Ag、Mo、Sn、Au等。虽然有些重金属如Zn、Cu、Fe、Co等是生物体的必需微量元素，但重金属一旦过量就会对植物产生毒害，轻则导致植物体代谢紊乱，抑制生长发育，重则致其死亡[7]。
铜（Cu）是主要的土壤重金属之一，同时也是重要的环境污染物。Cu因为具有氧化还原性，铜离子的氧化会造成超氧根离子的形成，进而导致H2O2和•OH的生成，因此铜损伤植物的作用机理之一是引起植物的氧化胁迫伤害。过量Cu容易引起植物的氧化胁迫和活性氧（ROS）积累。以往研究表明Cu胁迫会引起水稻甲硫氨酸亚讽还原酶（OsMSR)的表达显著增加,这说明OsMSRs可能参与了水稻对铜胁迫的响应[8]。而甲基紫精是一种非选择性接触性除草剂，被发现能够诱导化MSR基因家族中OsMSRA2.1和OsMSRB5的上调表达，在根系中尤其明显[9]。
目前有关重金属胁迫下MSR发挥何种作用的研究相对较少。相比其他生物体，高等植物拥有复杂的MSR基因家族。水稻的MSR基因家族包括4种MSRA基因和3种MSRB基因,分别是OsMSRA2.1、OsMSRA2.2、OsMSRA4（4.1和4.2）、OsMSRA5和OsMSRB1（1.1和1.2）、OsMSRB3、OsMSRB5，主要定位于叶绿体和细胞质中[10]。本文试通过构建ProA4-pGWB3和ProB3-pGWB3重组载体，并侵染入水稻。通过转启动子-pGWB3基因水稻苗GUS水解酶的表达情况，了解过量Cu和MV胁迫下，OsMSRA4和OsMSRB3基因的表达情况。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 植物材料
水稻梗稻品种日本晴(Ofyza sativa L.cv.Nipponbare)，水稻粳稻品种Dongjin（Oryza sativa L. var. japonica cv. Dongjin），黄杨（HY），种子由本实验室保存。
1．1．2 细菌菌株
大肠杆菌Escherichia coli DH5α 菌株，农杆菌Agrobacterium EHA105，菌种由本实验室保存。
1．1．3 质粒载体
pDonor，pGWB3，质粒由本实验室保存。
1．1．4 酶与试剂盒
实验室所使用的 rTaq DNA Polymerase、PrimeSTAR GXL DNA Polymerase、RNase A、BP Polymerase、LR Polymerase均购自大连 TaKaRa 公司；PCR相关试剂购自上海生工和大连 TaKaRa 公司；无水乙醇、氯仿、异丙醇等常用生化试剂均为国产分析纯。
1．1．5 主要仪器设备
实时荧光定量PCR仪，PCR 基因扩增仪，蛋白质核酸定量检测仪，台式高速冷冻离心机，制冰机，超纯水仪，高压灭菌锅，电泳系统，超净工作台、恒温摇床、超低温冰箱等。
1．1．6 培养基
LB 培养基：每升培养基含5g 酵母粉，10g 蛋白胨，10gNaCl。固体培养基
每升加 15g 琼脂。调节 PH 值至 7.2。主要用于大肠杆菌的培养。