高温胁迫下施镁对小麦碳氮代谢和产量的影响(3)
孕穗期每盆施MgSO4•7H2O 1.1275g(Mg20)，以不施镁肥为对照(Mg0)。分别于小麦花后14-20天(T1)和花后21-27天(T2)设置高温处理，昼/夜32/22℃，以昼/夜26/16℃为对照（T0）。人工气候室保持相对湿度均为65%，处理结束后移入T0条件下生长至成熟。
1．2测定项目与方法
1．2．1产量和产量构成因素
成熟期收取1m2样段进行实收计产，并测定每平米穗数。人工收割，人工脱粒，自然晒干后称重。
1．2．2光合参数
在花后0、7、14、21、28、35天测定标记旗叶的净光合速率。每处理取4片生长一致且受光方向相近的旗叶测定，三次重复。采用便携式光合速率测定仪LI-6400 （Li-Cor Inc，美国）测定小麦叶片净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、蒸腾速率（Tr）、胞间CO2浓度（Ci）。系统采用开放式气路，选择红蓝光源叶室，光合有效辐射（PAR）设定为1200 μmol m-2s-1，CO2浓度约为380 µmol L-1。
1．2．3生理指标
开花期选同一天开花、大小均匀的穗子进行挂牌标记，于花后21天、28天进行取样，样品按茎、叶、籽、颖分开，植株鲜样先于105℃下杀青30 min后，70℃烘干至恒重。同时另选生长一致的植株取其旗叶部分于-70 ℃液氮中冷冻 2小时后放入–40℃冰箱保存。用于等各项生理指标的测定。
1．2．3．1 氮含量、硝酸还原酶（NR）和谷氨酰胺合成酶（GS）活性
氮含量：烘干后植株样用磨样器磨成粉末，采用半微量凯氏定氮法测定氮含量（Zheng et al., 2009）。
硝酸还原酶：称取0.5 g样品，4 ml提取缓冲液（10 mmol L-1半胱氨酸（pH 8.7）, 1 mmol L-1 EDTA 和25 mmol L-1磷酸缓冲液（pH 8.7）），研磨匀浆，转移至10 ml离心管中，在4°C, 10000 g/min离心15 min，上清液为粗酶提取液。取粗酶液1 ml于10 ml试管中， 加入1.2 ml 0.1 mol L-1的KNO3磷酸缓冲液和0.4 ml 0.2 mmol L-1 NADH溶液，混匀，在25°C水浴中保温30 min，对照不加NADH溶液，而以0.4 ml 0.1 mol L-1 pH 7.5的磷酸缓冲液代替。保温结束后立即加入1 ml 1% 磺胺溶液终止酶反应。反应结束后加入1 ml 0.02% α-萘基乙烯胺溶液，显色1 h，于4000 g/min 下用普通离心机离心15 min, 取上清液在540 nm下测定OD值。
谷氨酰胺合成酶：称取0.5 g样品，置于预冷的研钵中，加入少许石英砂和5 ml 100 mmol L-1 Tris-HCl缓冲液（pH 7.6，含l mmol L-1 MgCl2、l mmol L-1 EDTA和10 mmol L-1 β-巯基乙醇）， 冰浴条件下研磨成糊状，于4°C，13000 g/min ，离心20 min，上清液即为粗酶液。反应体系组成为0.6 ml咪唑-盐酸缓冲液（0.25 mol L-1，pH 7.0），0.4 ml谷氨酸钠溶液（0.3 mol L-1, pH 7.0），0.4 ml ATP-Na溶液（30 mmol L-1, pH 7.0），0.2 ml MgSO4溶液（0.5 mol L-1），加入酶提取液0.6 ml，在25°C水浴锅中保温5 min后，加入0.2 ml羟胺试剂，开始反应。反应液再在25°C水浴锅中保温15 min后，加入0.8ml三氯乙酸-三氯化铁-盐酸混合液终止反应。混合液在8000 g/min 离心8 min后，取上清液在540 nm下测定OD值。
1．2．3．2 蔗糖含量和可溶性糖含量
蔗糖含量采用间苯二酚法测定（Li et al., 2000）。
可溶性糖含量采用恩酮比色法（Jia and Zhang, 2008）。
1．2．3．3 蔗糖合成酶（SS）和蔗糖磷酸合成酶（SPS）
酶液提取和测定参照Douglas等（1988b）的方法，略做改动。取叶片/籽粒0.5 g，加5 ml 50 mmol L-1 Hepes-NaOH缓冲液（pH 7.5），冰浴研磨成匀浆，20 000 × g，4°C离心10 min，上清液为粗酶液。
蔗糖合成酶的测定：依次加入100 μl 50 mmol L-1果糖，100 μl 50 mmol L-1 尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG），100 μl Hepes-NaOH 缓冲液，50 μl 50 mmol L-1 MgCl2和30 μl粗酶液，30°C水浴保温30 min，然后100°C水浴1 min终止反应。反应液加100 μl 2 mol/L NaOH沸水浴10 min，冷却后加入3.5 ml 30% HCl和1 ml 0.1% 间苯二酚，摇匀，80°C水浴10 min。冷却后测定480 nm OD值。