基于双链DNA为模板合成铜纳米颗粒用于DNA聚合酶的非标荧光检测(2)
超小的荧光金属纳米粒子作为有机染料和量子点的理想替代品，由于其卓越的光学性能，良好的生物相容性和简单的表面改性，以及其独特的物理和电学性质引起了人们在生化分析领域的研究兴趣。近年来，寡核苷酸为模板的荧光纳米粒子已经引起越来越多的关注，因为其可调的荧光发射，合成简单，高的耐光性和适用性，还可作为生物问题的诊断工具。最近，研究的DNA-银纳米簇在DNA的检测[15,16]、蛋白检测[17]，和细胞成像[18]等许多纳米材料领域得到非常广泛地应用，比如在分子生物学、细胞成像和医学诊断等领域。铜纳米颗粒对双链DNA模板的特异性使得它适合作为一种新型的荧光标记物。然而，目前对于双链DNA-铜纳米颗粒的研究仍处于非常早期的阶段。虽然仍处于起步阶段[19-22]，由于其合成方法简单、毒性低、优良的光谱和光物理性质等优点，荧光铜纳米颗粒有很高的应用前途，特别在生物传感方面已经引起人们越来越多的关注[23]。因此，利用荧光铜纳米颗粒作为检测荧光标记分析物的生物传感器的设计与构建仍然是非常重要的。
铜纳米颗粒是在低浓度的CuSO4溶液中，以双链DNA为模板合成的，这样合成铜纳米粒子具有优良的荧光特性，但是单链DNA则不能作为模板合成铜纳米颗粒。基于双链DNA为模板合成的铜纳米颗粒具有优良的荧光特性，毒性低，可用作荧光分子开关。
本文我们发展了一种非标荧光检测DNA聚合酶活性的方法。目标DNA聚合酶诱导发夹引物的聚合延伸生成双链DNA产物，然后以此双链产物为模板合成铜纳米颗粒具有荧光特性，进而做信号输出，从而实现对目标DNA聚合酶的非标记荧光检测。无DNA聚合酶不能发生聚合延伸反应，就不能生成双链DNA产物进而无荧光增强。该方法是首次利用双链DNA为模板做信号输出检测DNA聚合酶的活性，为DNA聚合酶的分析及相关生物医学的研究提供了一个简便的方法。
1 实验部分
1.1 实验仪器
Cary Eclipse型荧光分光光度计（中国安捷伦科技有限公司）；D1008型掌上离心机（北京大龙兴创实验仪器有限公司）；XK96-A型快速混匀器（江苏新康医疗器械有限公司）；FE20K型台式酸度计（梅特勒-托利多国际股份有限公司）；电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）；移液器一套（北京大龙兴创实验仪器有限公司）。
1.2 实验药品和试剂
抗坏血酸钠，硫酸铜(CuSO4)，Klenow fragment，exo-(KF exo-)和dNTPs mixture购于生工生物工程（上海）股份有限公司。聚合延伸反应的缓冲液体系为Tris-HCl缓冲液，组成为10mM Tris-HCl，50mM NaCl，10mM MgCl2，pH=7.6。铜纳米颗粒合成的缓冲液为MOPS缓冲液，组成为10mM MOPS，150mM NaCl，1mM MgCl2，pH=7.5。DNA序列(HP)由自己用专业软件设计并通过生工生物工程（上海）股份有限公司合成纯化得到。序列组成为：(5'-3')
GAGGACATAGCGGCAGGATCAGTTACAGTGCGCACCTAAAGGGTGCG
1.3 实验步骤
实验准备：用Tris-HCl缓冲液将DNA溶解配制成浓度为20µM储备液，后分装成几份，拿出一份经过淬火过程形成稳定的发夹结构HP，放置在冰箱上层保存备用。
取0.6mL的离心管，加入7.5µL(20M HP),5µL dNTPs(3mM)和32.5µL Tris-HCl缓冲液，待混合均匀后，加入5µL不同浓度的KF exo-，混匀后放置在37℃下反应1h。接着加入230µL MOPS缓冲液和10µL抗坏血酸钠溶液(30mM)，并在25℃下孵育30min，接着向上述反应液中加入10µL CuSO4(3mM)，振荡混匀，室温放置10min后，立刻在荧光仪上进行检测，并及时保存记录数据。荧光激发波长设为340nm，发射光谱收集的波长范围为520-650nm，荧光数据的作图均使用专业软件Sigmaplot进行处理。
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