靶分子触发荧光探针制备研究+文献综述(3)
1.1.3 micro RNA的检测的挑战
虽然目前为止国内外学者对micro RNA的研究已经取得了相当大的进展，人们经研究证明micro RNA的表达水平与多种肿瘤的发展、转移、预后有紧密的联系，虽然机理尚不明确，但是对micro RNA的检测逐步发展成一种对肿瘤的监测手段，这是学者们研究的热点。然而，针对micro RNA的检测，存在着很多棘手的问题，如何完成micro RNA的体内精确检测面临着众多挑战。（1）由于疾病的发生往往是多基因作用的结果，所以，在检测过程中，就要求对micro RNA的检测要有选择性和较高的检测效率，以实现多种基因同时检测的目标。（2）由于在肿瘤等疾病的发生初期，其肿瘤标志物micro RNA的含量是及其低的，所以就要求对目标物质有很高的灵敏度，发展出微量或痕量的检测技术。（3）由于细胞内外的生化环境完全不同，所以生化反应也就有很大的差异，单纯的检测细胞外的micro RNA的表达水平是不足以全面的了解疾病的发展本质的。
1.2 分子信标的研究概况
分子信标(molecular beacon，MB)也称分子探针，是一种利用荧光进行检测的寡聚核苷酸的探针，其灵敏度高，特异性强，操作简便，还有不必从未反应的探针体系中分离出来即可进行荧光检测等优点，在分子生物学、基因组学以及医学领域有很重要的应用价值[6]。接下来将从三个方面来具体的介绍分子信标的工作原理以及发展历程。
1.2.2 分子信标的工作原理
分子信标的本质其实就是一段呈发卡结构的DNA序列，其发卡的环状部位是由大约20个碱基组成，属于特异性序列，与靶分子向匹配互补。发卡结构的颈部是由5-7个互补的碱基对构成，这样的颈部结合力使得靶分子不是太容易打开发卡结构又不至于太难，提高了实验的准确度，在颈环结构的5’端和3’端连接着荧光基团以及荧光淬灭基团[27]。在分子信标与靶分子杂交之前，颈部的结合使得荧光基团与荧光淬灭基团距离大约7-10nm，荧光基团在其特定波长的激光下会发生能级跃迁，从而发出荧光，但是由于荧光基团与荧光淬灭基团的近距离使得荧光共振能量转移的发生[28]。结果荧光基团的荧光就会被荧光淬灭基团所吸收，并且以热能的方式消耗掉，所以，当荧光基团与荧光淬灭基团靠近时，检测不到荧光信号。当有靶分子序列存在时，就会与分子信标的环部互补配对，为了形成更稳定的结构，形成的杂交分子的刚性结构使得颈部的发卡结构断开，因为单链的杂交分子较发卡结构更为稳定。此时，荧光基团与荧光淬灭基团的距离拉远，荧光基团的荧光不能被淬灭基团所吸收，荧光得以恢复[29]。基于上述原理分子信标实现了其快速、准确的检测手段的形成。
1.2.3 分子信标的参数选择
分子信标的性能参数主要包括荧光寿命、灵敏度、检测限、稳定性、荧光背景、选择性及反应速度等，通常，一个好的分子信标应该具备荧光寿命长、灵敏度高、检测限低、稳定性好、荧光背景低、选择性好及反应速度快等性能[8]。其中荧光基团与荧光淬灭基团的选择是最为关键的，荧光淬灭基团之所以能够淬灭荧光基团所发出的荧光，是因为荧光基团的最大发射波长与荧光淬灭基团的最大吸收波长相一致，基于此工作原理，在选择分子信标的两个关键基团时，要尽可能使两者的最大发射波长和最大吸收波长相重叠，才能使荧光淬灭的效果最好，降低荧光背景[9]。