4×分离胶缓冲液    18.17 g Tris,0.4 g SDS,加水溶解后用1 M HCI调整pH至8.8,定容至100 mL,
    4℃保存。
4×浓缩胶缓冲液    6.06 g Tris,0.4 g SDS,加水溶解后用1 M HCl调整pH至6.8,定容至100 mL,
    4℃保存。
10%过硫酸铵    0.1 g过硫酸铵,1 mL水,现配现用
10%TEMED    0.1 mL TEMED,0.9 mL水,4℃保存
蛋白提取液    50 Mm Tris-HCl,0.01 M 2-巯基乙醇,pH 8.0,4℃保存
4×样品缓冲液    2% SDS,0.1M Tris-HCl(pH8.0),0.01M 2-巯基乙醇,1g/L溴酚蓝,150g/蔗糖
电极缓冲液    0.025M Tris-HCl(pH8.3),0.192M甘氨酸,0.1%SDS
固定液    40%甲醇,10%乙酸,50%水
染色液    0.4 g考马斯亮蓝G250,40 g硫酸铵,8 mL磷酸,100 mL甲醇,定容至500 mL
R250染色液 125 mL甲醇,50 mL乙酸,0.5 g考马斯亮蓝R250,溶解一夜后定容至500 mL
12.5% SDS-PAGE分离胶
    15 mL分离胶缓冲液,25mL Arc-Bis,19mL蒸馏水,1mL10%过硫酸铵,20uL TEMED
5% DSD-PAGE 浓缩胶    10m浓缩胶缓冲液,6mLArc-Bis,24mL蒸馏水,0.36mL 10%过硫酸铵,90uLTEMED
1. 3. 2  蛋白样品的提取与准备
(1)将油菜种子碾碎,置于1.5 mL离心管中,加500µL蛋白提取液置于37℃摇床振荡2h;
(2)振荡好后在4 ℃、12000 rpm条件下离心20 min,取上清液;
(3)吸取20μL相同浓度的样品按4:1比例加入样品缓冲液;
(4)样品充分涡旋混匀并煮沸3~5 min待用。
1. 3. 3  SDS-PAGE过程
(1)组装凝胶装置,按照说明书组装好灌胶模具,配置1.5%琼脂凝胶,封胶,注意不漏胶;
(2)配置分离胶,加入过硫酸铵和TEMED后,轻轻搅拌使其混匀(过硫酸铵现配现用,操作时戴手套);
(3)小心将分离胶溶液灌入模具中(分离胶溶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm处);
(4)轻轻在分离胶缓冲液上均匀覆盖一层正丁醇压线,静置30 min,待分离胶凝固,同时配置浓缩胶备用;
(5)倒去分离胶上的正丁醇并用蒸馏水缓慢冲洗两遍,用滤纸吸干胶面上的残留水分,灌入配置好的浓缩胶,插入梳子,静置20 min至浓缩胶凝固;
(6)将电极缓冲液加入内外电泳槽中,小心拔出梳子,用细针将歪倒的胶拨正,用微量进样器赶走加样孔中的废胶和气泡;
(7)将准备好的样品和蛋白Marker加入进样孔,接通电源,电泳条件开始设为恒压80V,待溴酚蓝带完全进入分离胶后,电压加倍;
(8)当溴酚蓝带距玻璃板下沿1 cm处时结束电泳,取出凝胶并做好标记;
(9)蒸馏水洗1~2次,室温摇床固定30min,弃去固定液,放入适量考马斯亮蓝R250或G250染色30 min~2 h(视具体染色情况而定),换上脱色液,摇动脱色至条带清晰;
(10)将凝胶放入天根凝胶成像系统中拍照扫描,读胶。
1. 4  数据分析
    根据电泳结果计算出每个品种迁移谱带的Rf值【11】,用0、1表示电泳条带的有无,在相同值位置上有蛋白质条带的记为1,而无带记为0。
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