酿酒酵母中SNARE蛋白Use1影响细胞自噬蛋白Atg8定位的研究(2)
囊泡运输作为真核细胞内同样极为重要的过程，与细胞自噬过程息息相关。囊泡运输过程在所有的真核生物中是相当保守的，主要包括运输囊泡的出芽(budding)、定向移动(transport)、拴留(tethering)、锚定(docking)和膜融合(fusion)过程[3]。运输囊泡与靶膜融合具有特异性，这种特异性依赖多种跨膜蛋白和可溶性蛋白，如：衣被蛋白、SNARE（可溶性N-乙基-马来酰胺敏感因子结合蛋白受体）蛋白、SM蛋白等[4]。其中SNARE蛋白是这个融合过程中的关键因子。来源不同的Qa-，Qb-，Qc-及Qr-的蛋白形成四聚复合体介导膜泡融合过程，通过功能进行分类，SNARE蛋白可以分为v-SNARE蛋白和t-SNARE蛋白，前者定位于运输小泡上，后者定位于靶膜上 [5]。
迄今为止，在酿酒酵母发现有24个SNARE蛋白，分别参与囊泡运输过程中的内吞运输与分泌运输的不同环节 [6]。近年来，很多SNARE蛋白被发现参与了囊泡运输过程的同时也参与了细胞自噬过程。比如，参与内吞运输的SNARE蛋白Pep12的缺失使自噬体堆积在液泡外，呈新月状，不能进入液泡降解[7]。此外定位于高尔基体的SNARE蛋白Sed5(Qa-SNARE)，它介导内质网到高尔基体的顺向运输，同时也参与自噬过程中Atg9从线粒体到细胞自噬装配起始位点PAS的运输。而其它与Sed5作用形成SNARE蛋白的复合体的SNARE蛋白Bos1、Bet1和Sec22也被发现调控着细胞自噬过程中的不同阶段[8][9]。
除了内质网到高尔基体的顺向运输相关蛋白参与细胞自噬外，从高尔基体到内质网的COPI囊泡逆向运输相关蛋白也参与了细胞自噬过程。比如，与COPI囊泡生成相关的COG大分子复合体参与细胞自噬过程[10][11]，而担负着COPI与内质网融合过程的SNARE蛋白Ufe1则通过直接调控COPII囊泡参与细胞自噬[12]。参与COPI囊泡与内质网融合过程的还包括其它SNARE蛋白，其中就包括Use1蛋白。本研究采用荧光显微镜观察细胞自噬的关键蛋白Atg8在细胞内定位的变化，进而探讨SNARE蛋白Use1是否参与细胞自噬及对Atg8定位的影响程度。实验结果在解析细胞自噬的调控及囊泡运输与细胞自噬间的关系有着极大的意义。
1 材料与方法
1．1 实验器材
1．1．1 酵母菌株
编号
Number 菌株
Strain 菌株来源
Source
YHY1616 BY4722 GFP-Atg8 其他实验室
YHY1701 use1-10AA GFP-Atg8 本研究
1．1．2 质粒
编号
Number 质粒
Plasmids 菌株来源
Source
PYH927 pRS416-Green 本实验室
PYH1165 pRS416-ADHpro-GFP-Use1 本实验室
PYH125 pRS423 本实验室
PYH1282 pRS423-Use1 本研究
1．2 主要试剂和仪器
1．2．1 主要试剂
rTaq酶，高保真DNA聚合酶，T4连接酶及限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ等分子生物学相关反应所用试剂为TAKARA公司产品，质粒提取试剂盒为上海生工生物有限公司产品，实验所用氨基酸等试剂为美国Sigma公司产品。
1．2．2 主要仪器
PCR仪（TaKaRa公司产品），生化培养箱（型号：SHP-150）、隔水式恒温培养箱（型号：GRP-9050）、电热恒温培养箱（型号：DRP-9052）（上海森信实验仪器有限公司产品），凝胶成像分析仪JS-680B（培清公司产品），琼脂糖电泳槽（北京优尔一仪器厂产品），稳流稳压电泳仪（型号：DYY-6B）（南京大学产品），倒置荧光显微镜（日本尼康公司产品）。