Zebularine诱发小麦异染色体系染色体变异体的研究(3)
1.3.2种子处理
（1）种子挑选：挑选大小一致饱满的种子，分别放入大离心管中，每管放入200粒种子。放入对照培养皿的种子数目分别为36，46，57粒，诱变每次重复三十粒种子。
（2）诱变处理：将zebularine母液与ddH2O分别放入03和01编号的离心管中，每管500 ml，用封口膜将离心管封住，拧紧离心管盖子。放入诱变培养箱24℃中培养72 h。
1.3.2种子发芽处理
（1）准备培养皿：在大培养皿用标记笔分别写上编号，编号和种子的编号相同，放置两层大滤纸。
（2）清洗离心管：穿戴好保护工具，拿出离心管，揭开封口膜，将离心管中的液体倒出。用于对照的离心管不需要进行清洗，诱变处理的用ddH2O清洗三遍，每次不能使液体流出，并且每回倒置两到三次，充分清洗。目的是将粘在种子上的zebularine清洗干净。
（3）放置种子：在培养皿中滤纸上滴上几滴ddH2O，用手指将水涂抹均匀，不能有气泡产生。将处理的种子分别放置在与其编号相同的培养皿中，按照一定顺序放置。
（4）种子培养：将培养皿放入24℃培养箱中培养，培养至根尖长到1.5-2㎝，剪根。
1.3.3 剪根处理
离心管喷少许水，保持根尖湿润，用铅笔在滤纸条做上记号，放入管中。选取合适根尖放入离心管中，每管三至五条根，注满水。冰水浴处理24-30 h
1.3.4根尖细胞有丝分裂中期染色体制片
取根尖置于冰水混合物中预处理24 h，进行笑气处理2 h，转至70%冰醋酸固定10 min，转入盛有70%的乙醇中保存，用45%乙酸解离制片，相差显微镜下染色体观察，标记分裂象良好的制片，然后置于-70 ℃冰箱隔夜冻存，揭去盖玻片后放入无水乙醇中脱水1h以上，取出，晾干，镜检备用。
1.3.5发芽率统计
每批材料剪过三次根之后，开始统计发芽率，即数培养皿中种子总数与发芽种子数，计算发芽率，记录数据。
1.3.6 荧光原位杂交探针标记
黑麦基因组DNA的提取和探针标记参考马旭辉[12]
黑麦基因组DNA探针标记采用缺刻平移法（50 µL体系），具体程序为dNTP 5.0 µL，10×Buffer 5.0 µL，DNA polymeraseⅠ3.0 µL，DNaseⅠ （1:1000）1.2 µL，Fluorsecein-12-dUTP 1.0 µL，Template DNA 2.0 µL （约为8000 ng），最后加ddH2O补足总体积至50 µL。探针混合液混匀后16 ℃温育2 h，-20 ℃保存备用。
1.3.7荧光原位杂交程序 ：
（1）配制杂交液（一张制片）：杂交液混匀之后（其中Oligonucleotides probe，简称oligo-probe），105 ℃加热变性13 min，之后置于-20 ℃ 100 %冰酒精中冷却10 min以上，备用。
配制方法：一张制片体积为13.9µL，包括20×SSC 1.5µL，50%DS 1.0µL，dFA 7.5µL，SSDNA 0.5µL，基因组探针 2.0µL，Oligo-probes 1.4µL。其中Oligos-probe为寡聚核苷酸探针，绿色信号为（GAA）10，用于评估含有不同数目的重复单元的寡核苷酸的信号；红色信号为：pAs1-1、pAs1-3、pAs1-4、pAs1-6、pSc119.2-1、AFA-3和AFA-4，所用探针和序列参考Du et al. (2017)[13]。
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