产葡聚糖酶木霉菌株的筛选及酶活分析(2)
1. 实验材料和方法
1.1 实验材料与试剂
木霉菌株为本实验室分离保存，筛选后从中选出高产菌株T-soybean。
葡萄糖，葡聚糖，土豆，琼脂，冰醋酸，醋酸钠，氢氧化钠，3,5-二硝基水杨酸，C4O6H4KNa，重蒸苯酚，Na2SO3，苯甲酸，过硫酸铵，Tris-盐酸，溴酚蓝(BPB)，β-巯基乙醇，谷氨酸(Gly)，十二烷基硫酸钠(SDS)，异丙醇，考马斯亮蓝R-250，醇等。
1.2 实验仪器
超净工作台，移液枪，锥形瓶，烧杯，恒温加热磁力搅拌器，量筒，玻璃棒，容量瓶，pH计，高压蒸汽灭菌锅，摇床，高速离心机，电子天平，蛋白垂直电泳仪，电磁炉，水平摇床，可见光分光光度计，电热恒温水浴锅，冰箱等。
1.3试验方法及过程
1.3.1高产葡聚糖酶木霉T-soybean的筛选
(1) 培养基的配制
称取200g马铃薯，削皮洗净，切成小块儿，用水煮半个小时，用纱布进行过滤，再往过滤液中溶解20g葡萄糖和20g琼脂粉，充分溶解后定容至1L，分装锥形瓶，高压灭菌锅灭菌20-30分钟后取出，待培养基冷却至40-50摄氏度的时候在无菌超净台里面倒平板，配制成培养基A。称取200g马铃薯，削皮洗净，切成小块儿，用水煮半个小时，用纱布进行过滤，再往过滤液中加20g葡聚糖和20g琼脂，充分溶解后定容至1L，分装锥形瓶，高压灭菌锅灭菌20-30分钟后取出，待培养基冷却至40-50℃的时候在无菌超净台里面倒平板，配制成培养基B。
(2) 木霉的培养及产葡聚糖酶菌株的筛选
a 菌种活化：取已有菌种，在超净台里面接种在A固体培养基上面，28℃培养4天，重复操作三次。
b 挑取步骤A所得的培养皿中长势较好的木霉接种于培养基B中，28℃培养4天。
c 选取培养基B中长势较好并且产生透明圈的的木霉为可以产葡聚糖酶的木霉菌株即进一步实验的材料，完成筛选过程。
1.3.2不同因素对木霉T-soybean产葡聚糖酶的影响
a 碳源对木霉T-soybean产葡聚糖酶的影响
配制分别以葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖为唯一碳源且浓度为1%的PD培养基[14]，把已经筛选出来的木霉T-soybean在超净台中接种于上述四种培养基中，在28℃、120 r/min的摇床上培养四天，进行酶活测定。
b 温度对的木霉T-soybean产葡聚糖酶影响
取已经筛选出来的木霉T-soybean在超净工作台中接种在PD液体培养基上，分别在20℃、28℃、35℃、50℃、60℃、70℃、80℃，120 r/min的条件下培养4天，进行酶活测定。
c pH对的木霉T-soybean产葡聚糖酶影响
取已经筛选出来的木霉T-soybean接种在pH分别为5、6、7、8的PD液体培养基上28℃、120r/min培养4天，进行酶活测定。
d 葡萄糖初浓度对的木霉T-soybean产葡聚糖酶影响
取已经筛选出来的木霉T-soybean接种在葡萄糖浓度为1%、2%、4%、6%、8%的PD液体培养基上28℃、120r/min培养4天，进行酶活测定。
1.3.3酶活的测定
a 酶活的测定方法及原理
(1) 原理: 1,3(4)-β-D-葡聚糖苷键被β-葡聚糖酶水解，放出还原糖基团与3,5-二硝基水杨酸 (DNS试剂) 发生显色反应，其颜色的深浅与还原糖的含量成正比关系[11]，在540nm测其光的吸收值，查标准曲线 (以葡萄糖计)，可得到还原糖的量，据此计算β-葡聚糖酶的活力[15]。
(2) 仪器和设备: 分析天平 (精度0.1mg)，恒温水浴，计时器，可见光分光光度计，电磁炉，振荡混合器，pH计等。
(3) 试剂和溶液
① 乙酸钠缓冲溶液 (浓度为0.1M，pH值为5.0)
溶液A: 用移液枪取冰醋酸6mL，加蒸馏水定容至1000mL，制成0.1M醋酸溶液。
溶液B: 用天平称取醋酸钠8.2g，加蒸馏水溶解并定容至1000mL，制成0.1M醋酸钠溶液。
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