杂拟谷盗体内共生菌沃尔巴克氏体 Wsp和ftsZ 基因的PCR扩增和序列测定(2)
沃尔巴克氏体像大多数立克次氏体一样不能用人工合成的培养液和培养基在体外进行培养和繁殖扩群，因此用较为常见的体外培养和显微观察的检测微生物方法对沃尔巴克氏体进行体外研究是比较困难的[7]。但是最近几年，伴随着微生物学、生物化学、细胞生物学、遗传学和分子生物学技术的快速发展，更多的便捷有效的方法被用来鉴定各种寄主体内的沃尔巴克氏体，以及研究它的系统发生。目前，通过PCR技术可以有效地检测和分析沃尔巴克氏体的16s rDNA [8]、细胞分裂蛋白基因ftsZ[9]以及表面蛋白基因wsp[10]等基因。
近些年，研究人员进行了很多Wolbachia基因的系统分化分析。Braig等人[11]第一次从感染了Wolbachia果蝇的卵中成功地纯化出了一种被用来编码Wolbachia表面蛋白的基因，也就是wsp基因，后来他们又对wsp基因进行了一系列克隆和测序的研究，结果表明wsp基因的进化速度要远远比ftsZ的快。值得一提的是：直到现在为止，wsp基因也仍是被报道的Wolbachia的基因当中进化速度最快的基因之一，所以我们可以利用它的此项特点对Wolbachia进行更加细致的系统发育分析。Zhou等人[12]根据wsp基因的序列分析的结果又将A类和B类群细分成12个亚群（subgroups），其中A类群存在8个亚群，B类群存在4个亚群。现在随着新的Wolbachia品系的不断发现与记录，根据wsp基因序列的差异，之后又会有愈来愈多的新类群或组可以被我们确定。
本研究拟通过进行细胞分裂蛋白基因ftsZ和表面蛋白基因wsp等基因的PCR扩增、电泳检测、序列测定，序列比对分析并进行聚类分析，目的在于明确沃尔巴克氏体在所用的杂拟谷盗试虫种群体内的感染与否，若存在，其与其它昆虫的系统发生关系何如，以及为今后可能利用沃尔巴克氏体进行预防和控制防治杂拟谷盗害虫提供理论参考。
1.材料与方法
1.1供试昆虫
杂拟谷盗是明庆磊老师课题组实验室饲养的自繁种群。用小麦全麦面粉对两种试虫放在玻璃瓶（带有透气的盖子）进行饲养与保种，将玻璃瓶放在相对湿度为70%、温度为29℃的恒温恒湿无光照黑暗的培养箱中。两种试虫分别在它们的蛹期通过在体视显微镜下观察腹部末端生殖叶鉴别拟谷盗的雌与雄，放在盛有面粉的塑料瓶中分开饲养（高9cm，口径6cm，底径5cm的塑料杯），羽化后等待使用。
1.2总DNA的提取
用准备好的研磨体以及各种试剂溶液提取试虫的DNA，详细的操作步骤参考王阿旻等[13]方法。
1.3 PCR 扩增和测序
wsp基因的扩增引物为：81F (5’-TGGTCCAATAAGTGATGAAGAAAC-3’) 和691R (5’-AAAAATTAAACGCTACTCCA-3’)[12] ；ftsZ基因的扩增引物为：ftsZ-F (5’-TACTGACTGTTGGAGTTGTAACTAAGCCGT-3’)和ftsZ-R (5’-TGCCAGTTGCAAGAACAGAAACTCTAACTC-3’)[14]。
PCR反应体系：Taq DNA聚合酶0.24 μL，上游/下游引物(10 ¬mol/L)各1.2 μL，2 × PCR Reaction Mix (TIANGEN) 15 μL，DNA模板1.2 μL，用双蒸水补足体积至30¬ μL。
PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；然后94 ℃变性50 s，再在50 ℃(wsp) / 62 ℃(ftsZ)退火45 s，接着72 ℃延伸60 s ，33个循环；最后72 ℃延伸10 min。
取PCR 扩增产物2 μL在0.8%的琼脂糖凝胶中电泳检测，并将其送至上海生工生物技术公司进行测序。