好氧降解木质素化合物的海洋微生物分离与鉴定(2)
1.3.11最适温度 7
1.3.12最适盐浓度 8
1.3.13 HPLC检测阿魏酸中间代谢产物 8
2.结果与分析 9
2.1 采样 9
2.2 分离的菌株 9
2.3 菌株分类鉴定 9
2.3.1 PCR扩增16S rDNA 9
2.3.2 纯化16S rDNA 10
2.3.3 测序 11
2.3.4检索并绘制系统发育树 13
2.4革兰氏染色 15
2.5最适温度 16
2.6最适盐浓度 16
2.7 HPLC检测阿魏酸中间代谢产物 17
3.讨论 17
4.致谢 18
参考文献 18
引言
在木质素的降解过程中,土壤微生物起到非常重要的作用，人们对它的研究也比较广泛和深入。木质素在土壤中的降解主要分为两个步骤：（1）高分子的木质素是一般由一些真菌负责降解。由真菌分泌的胞外酶可以把高分子的木质素降解形成低分子芳香族化合物；（2）在低分子的芳香族化合物降解过程中，细菌起到重要作用。细菌可以把低分子芳香族化合物转运出去后，完全分解生成二氧化碳。
由于海洋中的植物不受重力和风力等客观条件的影响，所以理论上海洋里基本不会存在木质素。但是，现实中大陆上合成的木质素及其衍生物会源源不断地沿着河川流向大海。而这些木质素及其衍生物在海洋中并没有被逐渐积累，而是被海洋细菌降解生成CO2，形成地球碳素循环过程中的一支独特的支流。但关于在海洋环境中木质素及木质素衍生芳香族化合物降解的原理，缺少充分的研究。海洋约占地球表面积的71%，富含大量的生物资源，海洋生物的物种多样性比陆地上的物质多样性还要丰富得多。因为海洋地域具有一定的特殊性，所以，在降解木质素化合物方面，海洋微生物与陆地微生物具有不同的代谢方式。通过海洋微生物中木质素及其衍生物的降解的研究工作，我们既可以获得新的降解途径及代谢产物，也能为海洋资源的有效开发与利用开辟一条新途径。除此之外，大自然环境的很多污染物质都类属于芳香族化合物，在研究过程中通过将香草酸作为唯一碳源和能源而分离筛选出来的能够降解木质素化合物及其衍生物的海洋细菌，具有降解大自然中的部分污染物质的能力。所以，分离得到的木质素降解菌可以广泛地应用到高盐环境或海洋环境的环境污染处理方面上，是解决环境污染的一条有效途径。
香草酸是一个苯甲酸，在4位有羟基，在3位有甲氧基。它是木质素代谢过程的重要中间体，在芳香族化合物的代谢过程同样也中起着主导作用。香草酸的降解途径见图1所示：首先，香草酸被脱甲基酶（Demethoxylase）催化，甲基丢失，生成原儿茶酸（Protocatechuic acid）；其次，原儿茶酸被双加氧酶（Dioxygenase）催化使其开环；经过一系列的降解，最后和糖酵解途径或三羧酸循环合并。
阿魏酸（Ferulate, FA）是合成木质素过程的中间体，是一种C6-C3化合物，在木质素高分子化合物中的重要作用是连接苯环。研究表明，阿魏酸的降解从侧链开始主要有两大途径。第一条途径：非氧化脱羧酶催化其去除一个碳生成4-羟基-3-甲基氧苯乙烯（4-Hydroxy-3-methoxystylene）；第二条途径：β-氧化途径。第一个酶（阿魏酰-CoA合成酶（Feruloyl-CoA synthase））将阿魏酸和CoA连接生成阿魏酰-CoA；第二个酶（裂解阿魏酰-CoA相关酶）会进行催化阿魏酰-CoA生成香草醛。
本研究主要利用香草酸作为分离实验过程中唯一的碳源和能源从海洋环境中分离降解香草酸的海洋细菌，以此来揭示海洋环境中芳香族化合物的降解原理。我通过富集培养技术从连云港海水和海底泥沙分离出三个菌株，并对其中两个菌株进行了分类鉴定。通过本次研究，一方面可以不断积累海洋环境中芳香族化合物降解的相关信息，阐明海洋环境中芳香族化合物的碳素循环过程，另一方面也有利于海洋生物资源的开发利用。