1 材料与方法
1.1供试材料
海水或海底泥沙,试剂化合物,培养基。
1.1.1 海水
海水取自连云港海水和海底泥沙。
1.1.2 试剂化合物
(1)普通化学试剂
氯化钠等各种无机盐、香草酸等有机化合物、蛋白胨、酵母提取物等培养基试剂均从上海生工生物科技有限公司(上海,中国)购买。
(2)分子生物学试剂
DNA连接酶、限制性内切酶等试剂、PCR扩增试剂盒、T-载体(pUCm-T)、扩增16S rDNA的上游引物Ecoli16S-27F(5’ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’),下游引物Ecoli16S-1492R(5’ GGTTACCTTGTTACGACTT 3’)均从上海生工生物科技有限公司购买。
1.1.3 培养基
(1)海水液体培养基ONRTa:
Solution A:22.79 g NaCl,0.72 g KCl,3.98 g Na2SO4, 47.2 mg Na2HPO4,0.27 g NH4Cl,83 mg NaBr, 27 mg H3BO4,31 mg NaHCO3,1.3 g TAPSO,2.6 mg NaF, 890 ml H2O。pH=7.6。使用高压灭菌锅灭菌。
Solution B: 1.46 g CaCl2﹒2H2O,11.18 g MgCl2﹒6H2O, 24 mg SrCl2﹒6H2O,100 ml H2O。使用高压灭菌锅灭菌。
Solution C:0.02 g FeCl4﹒4H2O,100 ml H2O。过滤灭菌。
按照Solution A 890 ml,Solution B 100 ml,Solution C 10 ml的比例混合配制海水培养基。需要时加入碳源(0.2%香草酸)。制备固体培养基时需加2.5%琼脂条。
(2)富集培养基
0.2 g胰蛋白胨,0.1 g酵母提取物,加入海水培养基100 ml混匀。使用高压灭菌锅进行灭菌(注:Solution C 只能过滤灭菌,不能高压灭菌)。制备富集固体培养基的时侯需要在原有培养基的基础上加入2.5% 琼脂条。
1.1.4 各种试剂溶液的制备
(1)与琼脂糖凝胶电泳相关的试剂制备
50×TAE缓冲液:称量37.2 g Na2EDTA•2H2O,244 g Tris,并将其放置在1 L烧杯中;再向烧杯中加入去离子水约800 ml,使用玻璃棒充分搅拌均匀;继续加入冰乙酸(57.1 ml),混匀,使其充分溶解;然后使用去离子水使其定容至1 L后,并用少量NaOH调pH至8.5,使用高压灭菌锅进行灭菌,最后室温保存。
1×TAE缓冲液:用量筒量取20 ml 的50×TAE溶液再加入去离子水(约980ml)使其最终定容至1000 ml。
琼脂糖凝胶:在100 ml 1×TAE溶液中加入1 g琼脂糖,使用微波炉进行加热,使其完全溶解。
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