木质素酶产生真菌的分离纯化及鉴定(2)
1.2主要仪器 3
1.3试剂配制 3
1.3.1柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液(0.125 mol/L, pH值3.0 ) 3
1.3.2醋酸缓冲液(0.05mol/L, pH值4.5 ) 3
1.3.3 天青B(Azure B) 溶液(0.160mmol/L) 3
1.3.4双氧水溶液（2mmol/L, 500mL） 3
1.3.5愈创木酚（40mmol/L, 500mL） 3
1.4 培养基 3
1.4.1菌种纯化培养基（PDA培养基） 3
1.4.2真菌分离培养基 4
1.4.3 PDA-愈创木酚培养基 4
1.4.4 PDA-苯胺蓝培养基 4
1.4.5液体产酶培养基 4
1.4.6固体产酶培养基 4
1.5菌株分离纯化 4
1.6菌株初筛 5
1.6.1菌塞制备 5
1.6.2 PDA一愈创木酚平板显色试验 5
1.6.3 PDA—苯胺蓝平板褪色试验 5
1.7菌株复筛 5
1.7.1液态产酶试验 5
1.7.2固态产酶试验 5
1.7.3粗酶液的提取 6
1.7.4酶活测定 6
1.8菌种鉴定 7
1.8.1 菌种DNA的提取（CTAB法）与保存 7
1.8.2 PCR扩增ITS 7
1.8.3 电泳 7
1.8.4 菌株ITS鉴定 7
1.8.5 载玻片培养观察法观察菌种的菌丝[10]和孢子形态结构 7
2.结果与分析 8
2.1木质素降解菌的初筛 8
2.1.1分离单菌落 8
2.1.2 木质素过氧化物酶产生菌的定性筛选 8
2.1.3漆酶产生真菌的定性筛选 9
2.2木质素降解菌的复筛 11
2.2.1木质素过氧化物酶产生菌的复筛 11
2.2.2漆酶产生菌的复筛 13
2.3电泳图谱 16
2.4分类地位 16
2.4.1 1-1的分类地位 16
2.4.2 L7的分类地位 18
2.4.3 5-5的分类地位 19
2.4.4 F1-1的分类地位 20
3.讨论 22
4.致谢 22
参考文献 23
引言
纤文素类生物质是一种可持续的资源，可以作为有机燃料、化学、材料等的原料，同时可以以较低的价格大量的获得[1]。作为农业大国，我国拥有的秸秆资源十分丰富，在当今资源日益紧缺，环保问题越来越突出的时代，我国的秸秆的利用率十分低下，只有很低的比率被利用，大部分秸秆的处理方式是焚烧。这样的处理方式不仅加重了环境的负担，在资源问题日益醒目的今天更是浪费宝贵的资源。秸秆直接燃烧的热效率只有10%，如果将它们转化为气体或液体燃料，其热效率可达30%以上，秸秆转化为生物乙醇的工艺流程如下[2,3]：
木质纤文素由纤文素、半纤文素和木质素组成，木质纤文素是自然界中广泛存、可再生且数量巨大的生物质资源，但是目前的利用率确是十分低的。在生物质利用上，主要面临的困难是木质素的降解和转化，预处理在生物质转化为生物乙醇过程中扮演着重要的角色，也是整个过程费用昂贵的步骤之一[4]，其处理的目的如下图[5]。现在工业上选择降解木质素的方法大多是理化法，虽然可以除去一定量的木质素，但是却给环境造成了二次污染。相对于理化法，利用微生物降解木质素不仅可以降低能耗，缓解环境的污染，还可以提高资源利用率，降低成本等。因此选用生物方法去处木质素具有很大的价值。