木质纤文素原料预处理目的
图1 木质纤文素原料预处理目的
Fig.1 The goal of pretreatment on lignocellulosic material
    自然界中,动物是不能够对木质素进行有效分解的,木质素的分解任务的主要承担着是微生物,包括真菌,细菌与放线菌,其中起主导作用的是真菌,细菌与真菌则起到了辅助作用。目前研究热点的是真菌,包括白腐真菌、褐腐菌和软腐菌。姜明国、黎海菲等筛选的Bax菌株,经过15d的培养,Bax木质素培养基中的木质素从560mg/L降解为29 mg/L,降解率48.21%;对造纸污水培养基中的木质素从210mg/L降解到135mg/L,降解率为35.71%[2]。
近年来随着科学技术的飞速发展,生物预处理由于其独特的优势取得了很大程度的发展,但是在生产的过程中依然存在着一些不足。主要是微生物的生长周期长,对温度较敏感,微生物在适宜的温度下生长较快,温度过高或过低均抑制其生长,pH值对微生物的生长也有很大的影响,如白腐真菌在微酸性环境中菌体生长良好,且可较快产酶并且产酶量大,随着后期pH值的不断升高,菌体生长和酶的产量均受到抑制,酶活也相对降低。同时相对物理和化学预处理,微生物预处理时间较长,效率较低。目前研究的重点在于筛选可以简捷、快速、高效降解木质素的微生物。
本文主要利用定性与定量的方法筛选具有木质素降解能力的真菌,从腐木和树皮分离出真菌,并用PDA-愈创木酚与PDA-苯胺蓝培养基进行筛选,并对选择得到的真菌进行酶活的测定,同时进行了显微特征观察和ITS鉴定。本研究对农作物秸秆利用、环境保护、我国生态农业的可持续发展有着重要意义。
1实验材料与方法
1.1样本来源
    从校园足球场、玉泉河两旁树木、后山丛林等地点采集腐木与树皮经过分离后得到真菌。
1.2主要仪器
酶标仪;培养箱;高压灭菌锅;摇床;离心机;20μL、200μL和1000μL移液枪;无菌操作台;容量品;酒精灯;打孔器;培养皿;取样铲;接种针;电子天平;倒置显微镜;秸秆粉碎机;干燥箱;pH试纸;电泳仪;PCR扩增仪;电磁炉;微波炉;塑料培养皿;玻璃培养皿;2mL离心管;冰箱;三角瓶等。
1.3试剂配制
1.3.1柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液(0.125 mol/L, pH值3.0 )
    配O.l25mol/L的柠檬酸和柠檬酸钠溶液各500mL,然后分别取出适量混合均匀调至pH值为3.0。
1.3.2醋酸缓冲液(0.05mol/L, pH值4.5 )
分别配制500mL浓度为0.05mol/L的醋酸和醋酸钠溶液,然后分别取出一定量混合均匀至pH值为4.5。
1.3.3 天青B(Azure B) 溶液(0.160mmol/L)
    称量0.0489g天青B,用蒸馏水定容至1L。(分子量:305.83g/mol)
1.3.4双氧水溶液(2mmol/L, 500mL)
 取102μL30%双氧水,用蒸馏水定容至500mL。(双氧水分子量:34g/mol, 30%双氧水密度:1.11g/mL)
1.3.5愈创木酚(40mmol/L, 500mL)
     取2.22mL愈创木酚,用95%乙醇定容至500mL。(愈创木酚分子量:124.14g/mol,愈创木酚密度:1.12g/mL)
1.4 培养基
1.4.1菌种纯化培养基(PDA培养基)
配方:土豆200g,葡萄糖200g,琼脂200g,水1L,自然pH。方法:将土豆切成块,蒸馏水煮沸20—30min;然后八层纱布过滤,弃掉滤渣,得滤液;加入20g葡萄糖溶解,搅拌均均;补蒸馏水至1L;然后分装锥形瓶,根据比例分装琼脂条,加塞;121℃灭菌20min,冷却后贮存备用[6]。
1.4.2真菌分离培养基
    PDA固体培养基溶化后+过滤灭菌青霉素(20—100μg/mL),要等培养基基本不烫手时再加入。
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