山羊肌肉差异表达miRNA基因多态性分析(2)
单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism , SNP)会潜在的诱导或破坏miRNA与其靶位点的结合。目前，关于miRNA单核苷酸多态性研究分析的报道已不在少数。Giulia等检测到miR-96的一个点突变，可以降低miR-96前体发夹结构的稳定性，同时成熟miR-96合成降低，前体的水平未受影响，而当进行补偿性的突变恢复miR-96前体发夹结构时，成熟体miR-96的合成恢复，这说明突变抑制了前体的加工，原因可能是妨碍了Dicer酶裂解。此外，Landi等通过分析，在研究的104个与结肠癌相关的基因中发现了57个SNP，其中，CD86基因的C/G多态被发现是与捷克人群的结肠癌有直接关系的。 Sun与其同事开展了一个大规模的遗传分析实验，主要分析自然发生的miRNA多态性，他们认为一个单独的碱基改变，即使碱基改变的位置是在成熟miRNA序列以外，足可以影响该miRNA的产生和功能。Jeannette等也认为miRNA前体侧翼的突变也会引起一些生物学功能的改变。Yang等为了研究SNP与膀胱癌的关系，分析了41个miRNA发生相关蛋白的SNP位点，经过数据分析发现GEMIN3的AA型具有2.5倍于其他基因型的发病风险，不仅如此，由GEMIN4的启动子与内部的6个多态位点组成的一个单体型的发病风险亦是1.25倍于其他个体。除此之外，已有许多实验证明miRNA及其靶位点的多态性与乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌等癌症的发生、发展和预后有着十分紧密的关系。
因此，本研究以徐淮山羊、波尔山羊和海门山羊等三个品种共计135个个体为材料，对山羊miR-668-3p、miR-767、miR-323a-3p、miR-665-3p、miR-541-3p、miR-411c-5p、miR-129-3p、let-7e、miR-29a、miR-424-5p、miR-432、miR-495-3p、NovelmiR-65、NovelmiR-67、NovelmiR-77、NovelmiR-47、NovelmiR-72、NovelmiR-84、NovelmiR-70的等19个基因序列的遗传变异进行了研究。
2 实验材料
2.1 实验动物及血样来源
本实验选用三个山羊品种，即徐淮山羊、波尔山羊及海门山羊各45只。徐淮山羊血样采集自徐州市铜山县吕梁乡羊场；波尔山羊采集自徐州市丰县梁寨合作种羊场，海门山羊采集自南通海门羊场。所有试验羊均为18月龄左右。
2.2 实验试剂
普通试剂如：TE缓冲液；三羟甲基氨基甲烷(Tris•Cl)等；10×TBE缓冲液；0.5×TBE缓冲液；柠檬酸；柠檬酸钠；抗凝剂ACD；上样缓冲液；染色液；30% 丙烯酰胺；SSCP变性剂(10 mL)；葡萄糖；10% APS(过硫酸铵);Taq DNA聚合酶；DNA抽提缓冲液；EB染色液；dNTPs；5 mol/L NaCl；10% SDS；NaAc缓冲液；DL2000 Marker；蛋白酶K；PBS缓冲液；0.5 mol/L EDTA；1 mol/L Tris•Cl。
2.3 仪器设备
Eppendorf移液器系列；台式高速离心机；PCR仪；电泳仪；高速冷冻离心机；格兰仕微波炉；恒温循环器；电泳槽；脱色摇床；凝胶成像仪；紫外分光光度计；紫外分析仪；电子天平；自动三重纯水蒸馏器；超低温冰箱；普通冰箱；电热恒温水浴锅；电热恒温培养箱；超纯水仪；超声波清洗器。
3 试验方法
3.1 羊全血基因组DNA的提取
方法参照孙家节2010硕士学位论文。
提取好DNA之后，用NaNoDrop2000检测其浓度以及纯度，之后再进行琼脂糖凝胶电泳检测其条带是否清晰。若浓度或纯度太低，或者条带模糊，则DNA不宜使用，应重新提取。
3.2 PCR反应所需引物设计
本研究中所用到的所有引物都是使用Primer premier6.0软件自行设计，然后由上海生物工程有限公司合成。
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