酵母菌发酵生产γ-癸内酯的乳化体系构建及其对产物转化的影响(2)
2.2.2 发酵液中GDL的萃取率计算 6
2.2.3 发酵培养基成分的优化 6
2.2.4 添加不同表面活性剂形成的乳化体系对产物转化影响的研究 7
2.2.5 底物与表面活性剂的浓度配比对GDL合成的影响 7
2.2.6 添加助表面活性剂所形成的乳化体系对产物转化影响的研究 8
2.2.7 不同复合体系对产物转化影响的研究 9
3实验结果与讨论 9
3.1 GDL标准曲线 9
3.1.1 精密度实验 10
3.1.2 回收率计算 11
3.1.3 发酵液中GDL的萃取率 11
3.2 发酵培养基成分的优化 12
3.3 添加不同表面活性剂形成的乳化体系对产物转化影响的研究 12
3.4 底物与表面活性剂的比例对GDL合成的影响 14
3.5 添加助表面活性剂所形成的乳化体系对产物转化影响的研究 15
3.6 表面活性剂复配后形成的乳化体系对产物转化影响的研究 16
3.6.1 复合体系的初步研究 16
3.6.2 复合体系的进一步研究 18
3.7 研究底物粒径与酵母对底物的利用及γ-癸内酯生产间的联系 20
4结论 21
致 谢 22
参考文献 23
附录 25
1绪论
1.1 本课题在国内外的发展概况及存在的问题
1.1.1关于发酵生产γ-癸内酯
（1） γ-癸内酯
γ-癸内酯（γ-Decalactone,GDL)是一种内酯类香物质，它是一个含有五元内酯环的十碳化合物，分子式:C10H18O2，分子量为170.25[1]。γ-癸内酯为无色液体，呈椰子和桃子香气，沸点153℃/2000Pa或114-116℃/66.7Pa，折射率(nD21.5)1.4610，微溶于水，易溶于有机溶剂，在其它溶液中的溶解度随该溶剂介电常数的增大而递减[2]。γ-癸内酯存在于桃、杏和草莓等水果中，也存在于乳制品的风物质中。1969年，γ-癸内酯被美国食品药品管理局认为是安全的食品添加剂和药物添加剂[3]。我国GB2760-86规定为允许使用的食用香料，它以其诱人的桃香和低香气阈值(水中为0.088ppm)的特性而得到香料工业的普遍应用，主要用于配制奶油、桃子、柑橘和椰子等类型香精。
（2） 生产γ-癸内酯的发展概况
由于天然香料不断增长的市场需求，促进了香精香料生产技术的迅速发展，尽管传统的化学合成和天然提取方法还在起重要的作用，但是利用生物技术生产香料化合物正受到人们越来越多的重视[4]。利用微生物发酵来模拟植物次级代谢过程可生产出香料化合物，而且这些香料化合物已被欧洲和美国食品法规界定为“天然的”。γ-癸内酯是手性分子，从水果中提取的γ-癸内酯具有特定的立体结构, 而化学法生产的却是消旋体[5]。因此，用生物法生产光活性的γ-癸内酯的工作吸引了许多研究人员的关注，并开展了大量的工作，对这方面的工作有大量文献进行了报道[4-6]。
早期，γ-癸内酯直接来源于水果和化学合成，后来食品研究人员通过微生物技术生产天然γ-癸内酯。1930年，研究者对Sporidiobolus属的几种菌能生产γ-癸内酯已有所了解。Tahara首次报道使用能产生香物质的酵母菌Sporobolomyces odorus生产γ-癸内酯[7]。近几年，国外申请的γ-癸内酯生产专利几乎全是生物法。采用生物技术可以通过3种途径得到γ-癸内酯: 生物合成法、生物转化法和生物催化法。
目前，随着人造香料需求的逐步加大，在γ-癸内酯生产工艺上，国外已形成了生物法与化学合成法共存的格局。现如今国内的研究者已经开始将重点转移到利用生物技术生产γ-癸内酯上，潘冰峰[8]第一次提出了利用生物法合成内脂类化合物，经过微生物次级代谢，脂肪酸生物转化，脂肪酶催化羟基酸等都可以转化合成内酯类化合物。王勇志等[9-10]研究了利用微生物法制备GDL，通过筛选较优菌株，优化培养基和培养条件等提高了GDL的产量。苏畅等[11]比较了sporidiobolus nuinenii、sporidiobolus salmonicolor、Yarrowia lipolytica、sporobolomyces odorus 发酵生产GDL能力，实验证明Yarrowia lipolytica最适合发酵生产GDL。随后，宋焕禄等[12]单独利用耶罗文亚酵母发酵蓖麻油合成GDL，其发酵产量达到1.9g/L，由此可知，利用生物法制备GDL是可行的。陈玉勇[13]对几株酵母进行筛选，得到发酵产生GDL能力较强的红酵母，GDL产量有了明显提高，表明红酵母有发酵蓖麻油产生GDL的能力。闫淑芳等[14]利用转化液二次接种的方法，该补料添加工艺使GDL达到4.0g/L。随着对发酵条件研究的逐步深入与完善，研究者开始对菌体进行改变以提高GDL产量，宋焕禄对两株锁掷孢酵进行紫外诱变，诱变后GDL产量提高到6.0g/L，苏畅[15]利用连续的化学诱变方法筛选GDL高产菌株，利用5L与50L发酵罐进行放大试验，GDL产量达到3.2 g/L，有效提高了蓖麻油的转化率，GDL产量比原始菌株提高了5倍。王聪[16]利用紫外线和化学诱变相结合的复合诱变方法筛选耶罗文亚高产菌株，使GDL产量为出发菌株的2.3倍。研究者[17]发现，产物对菌体的毒性作用是导致GDL产量不能大幅度提高的主要原因，为降低产物抑制作用，研究者做了大量工作，比较了GDL和其前体物质4-羟基癸酸对菌体毒性的强弱。从结果发现，相对于内酯而言，羟基酸对微生物细胞的生长的毒性小得多。研究者利用协同发酵的方法[18]，使用有油脂水解活性的地霉属菌株与有内酯合成能力的棒状杆菌属菌株进行协同发酵转化蓖麻油生产GDL。发酵产物用气质联用方法进行检测，结果显示，使用具有油脂降解能力的地霉属真菌协同发酵较单独使用棒状杆菌发酵时GDL的产率有明显提高。采用分离耦合的方法，用大孔树脂吸附产物[19]，通过添加树脂AB-8吸附转化产物以降低高浓度产物对细胞的毒性，进而提高产量，确定了蓖麻油添加量25 g/L、树脂量7.5%、pH 7.5的最佳优化工艺，产物的最大比生成速率提高36%且达到最大值后降低较慢，有利于产物积累，56h后总产量达到2.17g/L，耦合工艺在提高产量的同时又能较好地实现产物的分离。