1.材料与方法
1.1试验材料
1.1.1试供土壤
来自周口市川汇区附近实施过农药的农田及果园土样,共5份土样
1.1.2试验试剂
    20%氰戊菊酯乳油,NH4NO3 ,(NH4)2SO4 ,KH2PO4,K2HPO4,MgSO4•7H2O,NaCl,蛋白胨,酵母膏,明胶,蒸馏水,琼脂粉,1.6%溴甲酚紫乙醇液,葡萄糖,果糖,麦芽糖,乳糖,甘露醇,蔗糖,吲哚试剂,路哥氏碘液,3%-5%过氧化氢,ɑ-萘酚,甲基红,牛肉膏,40%NaOH,柠檬酸钠,NH3H2PO4,1%苯酚红,贝立脱试剂
1.1.3实验仪器
表1 主要仪器一览表
仪器名称    型号    生产厂商
电子天平    AR124CN    上海奥豪仪器有限公司
精达恒温培养摇床    ZHWY-2102    金坛市精达仪器制造有限公司
万用电炉    DL-1    北京中兴伟业仪器有限公司
生化培养箱    LRH系列    上海一恒科技有限公司
荣声冰箱    BCDR23    广东省顺德市荣贵区荣贵路
洁净工作台    SW-CJ-2FD    上海博迅实业有限公司医疗设备厂
立式压力蒸汽灭菌器    LDZX-50KB    上海中安医疗器械厂
中佳高速离心机    HC-3018    安徽中科中佳科学仪器有限公司
普析紫外分光光度计    TU-1810    北京普析通用仪器有限责任公司

1.2试验方法
1.2.1培养基
    无机盐培养基(500 ml):NH4NO3 0.5 g,(NH4)2SO4 0.25g,KH2PO4 0.25 g,K2HPO4 0.75 g,MgSO4•7H2O 0.25 g,NaCl 0.25 g ,蒸馏水500 ml,pH值7.0【1】;
LB液体培养基(500 ml):蛋白胨 5 g,酵母膏 2.5 g,NaCl 5 g,蒸馏水500 ml,pH值7.0(固体加1.8%的琼脂,均在121℃高压灭菌20 min)【1】;
葡萄糖蛋白胨水培养基:葡萄糖 0.5 g,蛋白胨0.5 g,K2HPO4 0.5 g,蒸馏水100 ml【5】;
 明胶试验培养基:明胶 12 g, NaCl 0.5 g,蛋白胨0.5 g ,调pH7.2-7.4蒸馏水100  ml,琼脂粉2.0 g【6】;
 糖类发酵试验培养基:蛋白胨1.0 g, NaCl O.5 g,1.6%溴甲酚紫乙醇液0.2 ml,pH 7.5,蒸馏水100 ml,另配20%糖溶液各1 ml,分装试管【5】;
吲哚试验培养基:蛋白胨0.2 g,葡萄糖0.5 g,KH2P04 0.3 g,蒸馏水100 ml,然后分装试管,每管4—5 cm;吲哚试剂:对二甲基氨基苯甲醛1.00 g,乙醇(95%)95 ml,浓盐酸20 m1【4】;
柠檬酸盐培养基:柠檬酸钠 0.2 g,K2HPO4 0.1 g,NH3H2PO4 0.1 g, NaCl 0.5 g,MgSO4 0.02 g,琼脂0.2 g,蒸馏水100 ml,1%溴麝香草酚蓝1 ml【4】。
1.2.2菌种的筛选及纯化
    菌种的筛选: 从采集到的5份土壤样品中每份各称取5g土壤,分别加入到含50 mg/L氰戊菊酯100mL的无机盐培养基中,然后将培养液放入30℃、120 r/min的恒温培养摇床中震荡培养72 h;待菌长出后按5%的接种量接种到同样的无机盐培养基中,传代过程中氰戊菊酯的浓度增大至200 mg/L,同样30℃、120 r/min震荡培养72 h;再次传代,同样取5%的继代培养液接种到同样的无机盐培养基中,氰戊菊酯农药浓度增至500 mg/L,30℃、120 r/min震荡培养72 h。
    菌种的纯化:摇瓶培养结束后,将分离出来的5份农药降解菌用平板划线法接种到LB固体培养基上并分别做一组平行对照,放入37℃恒温培养箱中培养48 h后发现有4份长出菌株,有一份培养液没有任何菌株生成。把这4份菌株分别命名为QBY01、QBY02、QBY03、QBY04。将筛选出的4份菌株取单个菌落各一环分别接种到100 mL液体 LB液体培养基中,30℃,120 r/min震荡培养增殖。24 h后发现3份LB培养液变浑浊(QBY01、QBY03、QBY04),有一份未变浑浊(QBY02);把3份浑浊的增殖后培养液做10^-1到10^-10的浓度梯度稀释,分别取10^-5到10^-10浓度阶段的菌悬液200 uL均匀涂布到LB固体培养基上并各做一组平行对照,放在37℃的恒温培养箱中培养48 h。待菌落长出后,取长势好的单菌落做斜面保存于4℃冰箱中保存菌种。
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