蜈蚣草磷酸盐转运蛋白的生物信息学分析与表达模式鉴定及PvPT3功能初步研究(3)
值得注意的是，这一研究仅提供了酵母表达系统中的证据，尚未在植物中验证PvPht1;3对As(V)的吸收功能。本研究前期获得了6个蜈蚣草中高亲和转运蛋白,除了已报道的PvPht1;1- PvPht1;3，还有3个磷酸盐转运蛋白基因的序列系首次发现。我们将通过分析其生物信息学特征和对砷胁迫的响应进一步从中筛选蜈蚣草砷高效吸收基因，分析这些磷酸盐转运蛋白基因在蜈蚣草As(V)高效吸收途径中的潜在功能，并通过PvPht1在转基因烟草中的过量表达进一步对基因功能进行验证，以期增加转基因植株对土壤中砷的富集能力，同时为揭示蜈蚣草超富集砷的分子机理提供题论依据。
1 材料与方法
1。1 生物信息学分析
1。1。1 蜈蚣草、水稻、拟南芥磷酸盐转运蛋白家族成员核苷酸序列的获得
蜈蚣草高亲和磷转运蛋白基因序列来自于实验室的蜈蚣草转录组数据库和华大1KP在线数据库。利用已经研究报道的模式植物拟南芥的基因磷转运蛋白AtPht1;1核苷酸序列作为模版，在两个转录组序列库中进行比对，分别获得若干条备选序列，将获得的目标序列片段进行整合分析比对,最终确定了蜈蚣草中的PvPht1家族基因PvPht1;1- 6。
拟南芥中磷酸盐转运蛋白核苷酸序列通过拟南芥基因信息在线数据库（http://www。arabidopsis。org/）查询获得。水稻中磷酸盐转运蛋白核苷酸序列通过密歇根大学水稻基因数据库(http://rice。plantbiology。msu。edu/index。shtml)查询获得。
1。1。2 PvPht1家族基因多序列比对、进化树构建及蛋白结构域分析
整理1。1。1中获得的蜈蚣草、水稻、拟南芥中的PT基因核苷酸序列，使用MEGA4。0分析三种物种中PT基因的进化关系、构建进化树。
使用NCBI数据库（https://www。ncbi。nlm。nih。gov/）对PvPht1;1-6的氨基酸序列进行蛋白结构域预测；并使用DNAMAN软件对获得的PvPht1;1- 6基因氨基酸及核苷酸序列进行多序列一致性分析，对PvPht1;1- 6基因氨基酸序列进行队列分析。
1。2 表达模式分析
1。2。1 试验材料
植物材料：野生型蜈蚣草 (Peterisvittata)，蜈蚣草孢子采自美国弗罗里达洲。
试剂：霍格兰营养液配制所用试剂购自国药；RNA提取采用Sigma 公司试剂盒 Spectrum™ Plant Total RNA Kit；荧光定量PCR采用Biorad公司 CFX96 Touch™ 荧光定量 PCR 检测系统。
1。2。2 植物生长条件及采样
选取大小一致的生长状况良好的蜈蚣草孢子体幼苗（生长~90天左右，5-6羽片）。将蜈蚣草从土盆中移出，转入1/5霍格兰营养液适应培养7天。随后，为研究蜈蚣草中PvPht1;1-6在砷胁迫下的表达模式，对野生型蜈蚣草材料进行正常营养液（1/5霍格兰营养液，0μM As V）和砷胁迫（1/5霍格兰营养液，50μM As V）两种水培处理。24小时后，分别采集蜈蚣草地上部和根系组织，液氮速冻后保存于-80℃冰箱，待提取RNA。
1。2。3 植物总RNA提取、cDNA合成及RT-PCR反应
提取蜈蚣草RNA（采用 Sigma 公司试剂盒 Spectrum™ Plant Total RNA Kit），反转录合成cDNA一链；利用Biorad公司CFX96 Touch™ 荧光定量 PCR 检测系统对cDNA样品进行PCR定量检测，以分析PvPht1基因在As V胁迫条件下的表达情况。
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