棉花MAPK级联途径中MAPKK与MAPKK家族基因蛋白互作分析(3)

1．2 方法
1．2．1 目的基因的克隆以雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii）中预测到的基因为参考序列，利用Primer Premier 5.0设计特异引物，以棉花材料TM-1的cDNA为模板，利用PCR扩增的方法，扩增出目的片段。PCR扩增产物通过1%的琼脂糖凝胶电泳分离，采用Axygen胶回收试剂盒回收目的片段。接着使用ClonExpress®快速克隆技术将回收到的片段直接连接到目的载体上。
1．2．2 连接产物的转化与检测通过大肠杆菌转化的方法，将载体转化进入感受态细胞，在超净台上进行操作。然后涂板，倒置于37℃培养12~16h。每板挑取6-12个单克隆，接菌于含有合适抗生素的LB液体培养基37℃培养4-6h。取2μL菌液作为PCR模板，使用M13通用引物进行检测，并用特异引物进一步检测。阳性克隆的菌液送交生物技术公司进行测序。