高效矿物风化细菌假单胞菌风化黑云母的生理机制初探(2)
1 材料与方法 1．1 材料 1.1.1 供试菌株 来自实验室保藏的一批初筛菌株，需进一步分离、纯化与鉴定。
1.1.2 供试矿物 选取黑云母作为供试矿物（元素组成见附表1） ，经粉碎、研磨后收集100~300 目之间的颗粒，用超声波清洗，在 pH 为4.0 的盐酸溶液中浸泡过夜，再用去离子水清洗若干次，直至溶液澄清并且 pH达到7.0，烘干备用。 1.1.3 培养基 LB培养基： 10g 胰蛋白胨， 5g 酵母粉， 10g NaCl， 1L蒸馏水，调 pH 值至 7.0， 121℃，灭菌25min（配制固体培养基时，加琼脂20g） 。 BHm培养基：0.02gKCl，0.15gMgSO4•7H2O，0.08gNaH2PO4•2H2O，0.09gNa2HPO4•12H2O，0.065g(NH4)2SO4，0.1gKNO3，0.02gCaCl2，2.0g葡萄糖，1L蒸馏水；调pH至7.0，115℃，灭菌30min。 1.1.4 主要试剂 （1）氯仿/异戊醇（24:1）：将氯仿和异戊醇按照体积比24:1 混合 （2）1%的琼脂糖凝胶：取 2mL50*TAE加98mL去离子水先稀释成1*TAE，再加1g琼脂糖 （3）0.85%生理盐水：准确称取 0.85gNaCl，溶于100mL去离子水中 （4）6N H2SO4：166ml浓硫酸缓缓加到 800ml 去离子水中，稀释至1L （5）0.6N H2SO4：16.6ml 浓硫酸缓缓加到800ml去离子水中，稀释至 1L （6）5%钼酸铵：准确称取 5g 钼酸铵，溶于100mL 去离子水中 （7）5%草酸：准确称取 5g草酸，溶于100mL去离子水中 （8）5%抗坏血酸：5g抗坏血酸溶于100ml 6N H2SO4溶液中（现配现用） （9）铝试剂缓冲液（pH 3.9）：120mL冰醋酸用纯水稀释至 800mL，加NaOH10.5g，铝试剂0.35g，溶解后调 pH值至3.9 （10） 乙酸-乙酸钠缓冲液：称取13.5g乙酸钠加入12ml冰乙酸，加水后溶解稀释至500ml （11）1%盐酸羟胺：准确称取1g盐酸羟胺，溶于 100mL 去离子水中 （12） 0.1%邻菲罗啉：准确称取0.1g 的邻菲罗啉，先用少量乙醇溶解固体，再溶于 100mL去离子水中 （13）pH 为6.4 的柠檬酸缓冲液：将 0.1M柠檬酸与0.1M柠檬酸钠以1:9 混匀 （14）茚三酮显色液：称取 0.5g茚三酮、0.3g果糖，溶于100mL 去离子水中，避光低温保存 （15）氯仿：正丁醇（5：2）：将两者按照体积比混匀 （16）0.1mg/mL的葡萄糖母液：准确称取 10mg 葡萄糖，溶于100mL 去离子水中（17）90%苯酚溶液：90g苯酚溶于10mL去离子水中，室温可保存数月 （18）9%苯酚溶液：90%苯酚溶液稀释10 倍，现配现用
1.2 方法
1.2.1 可培养细菌的分离、纯化 将供试菌株用液体LB培养基活化2~3 次以后，于固体 LB培养基的平板上进行平板划线，并于30℃培养箱中倒置培养；纯化三次以后，待菌落刚长出时，即将平板倒置于4℃冰箱中保存待用。
1.2.2 供试菌株的分子鉴定 I. 细菌基因组DNA 的提取（高盐法） 将纯化后得到的菌株用 LB 培养基活化，高盐法提取细菌基因组总 DNA。 （1）菌体收集 取1ml菌悬液离心（6000rpm，5min） ，弃上清；沉淀重悬于550μL 1*TE缓冲液中。 （2）细胞破碎 加10mg/mL 溶菌酶10μL，37℃水浴2-4h。 （3）破坏蛋白，释放核酸 加50μL 20% SDS 和8μL 20mg/mL的蛋白酶 K，颠倒混匀，65℃水浴 2h，每隔15- 30min轻轻颠倒几下。 （4）DNA存在于NaCl溶液水相中 加200μL 5mol/L NaCl，上下颠倒15 次，离心（12000rpm，10min）取上清，移入新管（注意不要取到下面的沉淀）。 （5）抽提DNA，进一步去除蛋白 上清与等体积的氯仿/异戊醇（24:1）混匀，离心（12000rpm，10min） ，取上清，移入新管（注意不要吸到中间的蛋白质层） 。 （6）重复上述操作一次 （7）向上清加入0.6 倍体积的异丙醇，于 4℃静置0.5h，离心（12000rpm，10min） ，收集核酸沉淀。 （8）用预冷70%乙醇洗涤沉淀二次，离心（12000rpm，10min） ，弃上清，室温吹干；重溶于30μL 超纯水中，贮存备用。电泳检测是否成功提取细菌基因组总DNA。
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