苏淮猪耐粗饲相关肠道微生物特征初步解析(3)
1.2 日粮及饲养管理，
试验在江苏省淮安市淮阴种猪场内，在同栋猪舍、相同饲养条件下进行。试验苏淮猪每日饲喂2次，时间分别为上午8:30-9:30和下午14:30-15:30。试验过程采用干料喂养，饲喂时间段自由采食，全天自由饮水，日常管理与防疫按照淮阴种猪场内生产常规执行。
1.3样品采集
饲养实验结束后，空腹四小时全部屠宰。禁食12小时，自由饮水。宰杀时实行宰前电击晕法，然后采用颈部大血管放血法。采集结肠和盲肠内容物消化率样品，用10%稀硫酸进行混合处理后，保存于-20℃待用。采集结肠和盲肠内容物，于灭菌离心管中，保存于-80℃待用。
1.4样品筛选
进行纤文表观消化率测定。根据NDF表观消化率数据，分别选择7月龄和8月龄NDF消化率最高和最低的5头猪，对结肠和盲肠内容物分解纤文的菌落进行测定。
1.5主要试验仪器
高压灭菌消毒锅：上海申安医疗器械厂；恒温水浴锅：北京医疗设备厂；ANKOM A200i半自动纤文分析仪：梯度PCR扩增仪：美国ABI公司；超净工作台：上海博讯实业有限公司；DYY-III2稳压电泳仪：北京优尔一仪器厂；凝胶成像仪：美国BIO-RAD伯乐公司；实时荧光定量PCR仪：ABI7300，美国ABI公司；低温高速离心机(Centrifuge 581 OR)：美国Thermo公司；可调式微量移液器：美国Thermo公司；紫外分光光度计：美国Thermo公司；千分之一电子天平：德国Sartorius公司；定时恒温磁力搅拌器：上海沪西分析仪器厂。
2 肠道内容物纤文相关消化率测定及纤文分解菌数量测定
2.1 NDF、ADF表观消化率的测定
中性洗涤纤文(NDF)：采用GB/T20806-2006介绍的方法测定。其中消煮器为ANKOMA200i半自动纤文分析仪，100℃下处理75min。NDF（%）＝100×［1-（饲料中AIA的含量×粪便NDF中的含量）/(粪便中AIA的含量×饲料中NDF的含量)］。
酸性洗涤纤文（ADF）：采用NY/T1459-2007介绍的方法进行测定。
2.2 DNA提取
使用粪便微生物基因组 DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)进行粪便微生物总DNA的提取。将DNA原液稀释至5ng/μl备用。