鲫鱼肝源细菌的分离纯化与鉴定(2)
文隆气单胞菌(Aeromonas veronii)常引起鱼和其他水生或两栖类动物疾病，它是淡水水产养殖产业的一种重要的病原菌。文隆菌除了从鲫鱼中分离，还从黄颡鱼[8]中分离得到。文隆气单胞菌已成为重要的人-鱼共患致病菌[9]。由文氏气胞单菌引起的澳洲鳗鲡（Anguilla australis）赤鳍病[10]、中华鳖的穿孔病、腐皮病、口咽腔溃疡综合症等疾病[11-14]。因此研究文隆气单胞菌对了解动物疾病来源和如何防治具有重要意义。
本实验以鲫鱼（Carassius aumtus）肝脏内细菌为研究对象，从一条体表有少量鳞片脱落，腹部明显肿胀，胸鳍、尾鳍基部充血的鲫鱼肝脏中分离得到一株细菌，命名为JG，对其进行形态观察、生理生化实验、16S rRNA测序以及构建系统发育树等系统鉴定，从而为鲫鱼类淡水鱼种疾病的防护与治疗积累科学材料。
1 实验部分
1.1 实验材料
鲫鱼是从徐州某农贸市场购买的，重约60±5g，从杭州微生物药剂有限公司购置TSA培养基(15g大豆粉木瓜蛋白酶消化物、15g酪蛋白胰酶消化物、5g氯化钠、15g琼脂、1000ml纯化水，分装灭菌，无菌操作后加盖在室温下放至凝固)，TSB培养基（5g大豆蛋白胨15g胰蛋白胨、、5g氯化钠、1000ml纯化水，121℃蒸汽灭菌后备用），LB培养基（胰蛋白酶2g、琼脂粉3.6g、氯化钠2g、酵母提取物1g，高压灭菌，待温度降至55℃时加入抗生素，灭菌后倒置保存）以及细菌微量生化鉴定管。在上海生工生物工程有限公司购置DNA胶回收试剂盒、Master Mix、细菌基因组提取试剂盒等，pMD18-T Vector试剂盒来自TaKaRa公司。
1.2 实验方法
1.2.1细菌的分离纯化、形态观察及理化性质
参照吕爱军等[7]的方法进行细菌的分离纯化，通过无菌操作取出鱼肝脏置于TSA培养基上，采用四区划线法对JG菌株进行分离，26℃温箱培养24h，挑取单个完整菌落，反复传代3-5次，将纯化得到的单菌落命名为JG。取纯菌落接种于JG 的LB培养基上，4℃环境下保存备用，并观察记录细菌形态。革兰氏染色JG菌：先将涂片固定好，用草酸铵结晶紫染液初染约1分钟，然后用纯净水冲洗干净，再将碘液覆盖涂片表面媒染约1分钟，用纯净水冲洗后将多余的水吸除，滴加数滴浓度为95％的乙醇，之后缓缓晃动进行脱色，20秒后冲洗，吸除多余的水，最终用稀释过的蕃红染液复染约1分钟后，用纯净水冲洗，室温干燥，及时镜检。对JG菌株进行生化鉴定，参考王利[15]等的方法，我们将纯化菌株接种于细菌的生理生化鉴定管中，进行枸橼酸盐利用、H2S实验、脲酶、糖（醇及苷）等理化性质的鉴定。鉴定JG菌株的标准是《伯杰氏系统细菌学手册》[16]