单子叶植物CRISPR载体的构建(2)
CRISPR-Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated proteins)系统是细菌与古生菌中用来抵御外源病毒或质粒 DNA 入侵的获得性免疫系统。对于一个典型的CRISPR位点而言通常包含若干长度为20-50bp的保守性的正向重复序列和被其间隔开的短的非重复序列，以及位于重复上游的引导序列[3]。CRISPR系统存在三种类型，尤其以II型CRISPR系统研究较多，在II型CRISPR系统中存在Cas9核酸酶，又称CRISPR/Cas9系统。Cas9核酸酶具有改造crRNA和破坏双链DNA的双重功能[7]。位于sgRNA5‘端的20个左右的碱基决定CRISPR/Cas9系统在应用时Cas9核酸酶特异性切割的部位，主要负责决定CRISPR/Cas9系统的特异性，因此，只要改变这段引导RNA序列即可使Cas9定位到新的DNA序列上，如果同时引用多个引导RNA也可同时进行基因组上多个不同位点的编辑，从而实现复合基因的编辑。
CRISPR/Cas9系统介导的植物基因的定点突变原理为：首先，Cas9蛋白与sgRNA形成复合体。其次，上述复合体切割与sgRNA的spacer互补的基因组DNA序列，随后造成双链DNA的损伤。最后通过体内的NHEJ或HR修复机制将引入基因突变[4]。
受序列的限制以往的CRISPR载体往往是两个载体，也即表达sgRNA和Cas9元件位于不同的载体，共转化效率较低，为了克服这一困难，我们采用酶切连接和Gateway技术构建便式表达载体。我们已经了解sgRNA 5‘端的20个左右的碱基决定CRISPR/Cas9系统的特异性，但是20个左右的碱基片段链接不方便，使用起来操作不方便效率偏低。本研究利用Gateway技术和改进后的定点突变技术将基因特异的靶序列构建到通用载体中得到表达特异基因sgRNA的入门载体，将其与目标载体同源重组即可得到特异的基因表达载体。
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