栝楼RTBs胚胎模式的新型转基因体系研究(2)
目前，栝楼的高频再生和转化体系至今还未建立，制约了栝楼乃至葫芦科植物如黄瓜等经济作物的现代遗传育种的进程。本研究以栝楼RTB（Rhizoid tuber）为受体材料通过小瓶真空抽提法建立的转化体系具有高效、简便和便于遗传改造等诸多优势。栝楼的RTB再生途径可被用来种质资源的保存和高效遗传转化体系的建立，所产生的转基因植株从单细胞发育而来，与外植体没有微管组织相连接，属于无毒植株。目前。以栝楼RTB为受体进行其再生和遗传转化体系构建的相关研究至今鲜有完整报导，因此具有重要的理论价值和研究意义。
1 材料与方法
1.1 材料
本试验所用的栝楼无菌苗由周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室培养。
1.2 培养准备
1.2.1 无菌苗培养
挑选大田栝楼雌株和雄株的外植体茎段，消毒后置于MS培养基上，约二周后可获得无菌苗。
1.2.2 RTB的诱导
类根体诱导培养基为MS+1.0mg/L NAA+30g/L蔗糖+3.6g/L结冷胶，pH5.8。RTBs（Rhizoid tubers）诱导培养基为MS+20.0mg/L TDZ+30g/L蔗糖+3.6g/L结冷胶，pH5.8。
1.2.3 RTB的胚萌诱导
诱导RTBs胚胎萌发需要在MS基本培养基中添加6-BA和特美汀以及卡纳等激素，配方如下：MS+5.0mg/L 6-BA +200mg/L 特美汀+100.0mg/L K+ +30.0g/L蔗糖+3.6g/L结冷胶，pH5.8。以上各种培养基均需121℃高压湿热灭菌20min，备用。
1.2.4 RTB转化渗透介质
渗透介质是由D-葡萄糖，MES，十二水磷酸钠，乙酰丁香酮，按一定比例配置而成。
以上各种培养基和转化介质均需121℃高压湿热灭菌17min，备用。
1.2.5转化质粒
转化所用空载质粒采用pBI-121。
1.3 方法
1.3.1 无菌苗获得
挑选大田中长势较好的雌株和雄株，先经75%乙醇进行表面消毒30s-1min，无菌水冲洗1次；再经0.1%升汞溶液消毒8-10min，无菌水冲洗3-5次。无菌条件下，用无菌镊子和解剖刀将茎段切成1.5-2.0cm的长度插于MS固体培养基上，每瓶1-2个，置于光照培养架上诱导侧芽发育，进而培养成苗。
1.3.2 外植体选择
将栝楼无菌苗叶片于无菌水中切成0.5×1.0cm2大小，茎段与根均为约1cm的小段，于无菌吸水纸上吸去多余水分，备用。
1.3.3 类根体的诱导
将外植体（叶）近轴面向上，茎段与根直接平放贴于浓度1mg/L NAA的MS固体培养基表面。然后于25℃条件下进行黑暗处理，约10d后，外植体出现很多白色类根体。
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