柞蚕丝蛋白水解酶产蛋白酶菌株的筛选(2)
1.2 蚕丝组成及结构 蚕丝由蚕体内的丝腺分泌，主要由约 70%丝素和 25%丝胶两部分组成，其他的杂质含量约为 5%，其主要成分丝素和丝胶都是蛋白质，丝素蛋白被丝胶蛋白包裹在里面。蚕丝中含有碳、氢、氧、氮、硫等元素，不同的蚕及不同的饲养环境都会影响蚕丝中各组分的含量[3]。 丝胶蛋白等电点pH为 3.9，丝胶含量多少是影响蚕丝质量好坏的重要因素，因此天然蚕丝要织成高质量的丝绸要经过“脱胶”这一工序来除掉杂质和大部分的丝胶。 丝素分子由排列整齐紧密的整列部分和排列松散的无定形部分，整列部分结构紧密，阻止了水分子的进入，不易与化学要紧进行反应；无定形部分含有大量的反应基团，且结构松散，与化学药剂易发生反应[4]。柞蚕丝的截面性状为呈扁平的椭圆，表面呈现纵向的线形条纹并且纤文表面不规则 。其蚕丝含有丝胶含量较多，颜色灰黑，韧性较差。
1.3 酶 1.3.1 酶的分类 早在游牧时代，人类虽然还不知道什么是凝乳酶，但是已经懂得使用小牛的胃液来制作奶酪，这就是原始的酶工程。 酶工程发展到现在，已经被人类发现了四千多种酶，但是生物体内的酶的种类远远大于这些。酶的分类也多种多样，国际生物化学协会按照酶的催化反应类型将酶分为氧化还原酶、水解酶、转移酶、裂解酶、合成酶、异构酶优尔大类[6]，每大类下面还根据底物或者作用基团分为若干个亚类。
1.3.2 酶的特性 酶由细胞分泌，本质大多数为蛋白质，小部分为 RNA，。酶能够改变原本反应的活化能，从而加快反应速度或者减缓反应速度，而对最终产物没有任何影响，自身也不会发生改变，并且能够脱离生物体而独立完成催化，与非生物催化剂催化方式类似。酶在催化过程中具有高度专一性，酶的活性中心与底物特异性结合，才能够进行催化。酶和底物结合后形成络合物，络合物也具有专一性，并改变了酶的溶解性、稳定性等理学性质[7]。
1.3.3 酶的分离纯化 分离纯化酶之前，要将酶进行预提取。将发酵后的菌液离心或者过滤。若所需酶为胞外酶，则取上清进行超滤、盐析、有机溶剂抽提等方法提取粗酶；若目的酶为胞内酶，则需要保留沉淀，进行细胞破碎后进行离心，保留上清进行预提取。 本实验采取硫酸铵盐析法，将蛋白酶提取出来。蛋白质在等电点时，由于各分子所带电荷相同相互排斥，并且蛋白质在水溶液中周围会产生水化膜，隔绝蛋白质分子之间聚集，故不能形成大分子而沉淀，加入强电解质后，产生的离子具有强烈的水化作用，使蛋白质表面的水化膜遭到破坏，并且蛋白质带有的电荷也会被中和，使蛋白质聚集而析出沉淀。硫酸铵具有较大的溶解度，而且水溶液中存在较高的离子浓度和较大的离子电荷，故常被用作蛋白质盐析[8]。 酶的分离纯化方法有很多种，常规的分离纯化方法有以下几种：凝胶过滤、疏水层析、离子交换层析、亲和层析等[9]，按照不同的酶可以适当的选择一种或者多种进行分离纯化，一种酶的提纯过程中常常用到多种方法共同作用。常规的分离方法费时费力，而且回收效率比较低，针对这些缺点开发出了一些新型的纯化分离方法，例如：膜处理方法、免疫纯化技术、双水相体系、界面亲和层析等[10]。 在提纯时，酶提纯后的用途也要作为影响因素，一般的工业用酶对纯度的要求不是很严格，过分提高酶纯度反而会影响成本。
1.3.4 酶的保存 大多数的蛋白质对温度敏感，在 35℃~40℃条件下，大多数酶就会逐渐失活，即使保存在 0℃~4℃中一周左右也会失活，并且酶制剂纯度越高，失活的速度越快，所以通常都保存在-5℃~-20℃中。但是有一些酶对低温毫无抵抗力，例如过氧化氢酶只能保存在 0℃~4℃中，处于冰冻状态后则会永久失活。 将酶浓缩至结晶或制成干粉则会保存更长时间，某些酶在干粉状态冷冻在-15℃下甚至能保存八年。一般含水量小于 3%即可抑制其化学活性，即能相对长期的保存。 将酶至于保护剂中保存时间也会相应延长很多，例如惰性化学试剂（氨基酸、多元醇等）、中性盐（硫酸镁、氯化钠等溶剂）、巯基试剂等，将酶保存在这些保护试剂中再放入低温下保存，将会几十年保留酶活性。
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