中华补血草内生与根际具ACC脱氨酶活性细菌的筛选及其生(2)
1.2 植物内生及根际细菌的分离
1.2.1 植物内生菌的分离：将植物样品剪碎进行超声清洗，用5%次氯酸钠处理3–5 min后用2.5%的Na2S2O3处理10 min，用无菌水清洗后再用75%的乙醇处理3–5 min，用无菌水清洗3–5次除去残留乙醇。取最后一次清洗样本的无菌水涂布到培养基上验证表面消毒是否彻底。将表面消毒的植物样本匀浆破碎并稀释至10–1–10–4浓度梯度，取10–2–10–4浓度的植物样本稀释液涂布于分离培养基上用于分离细菌。将表面消毒后的植物样本浸泡到10%质量浓度的NaHCO3溶液中10min，干燥后将植物样本放入于80–100 °C烘箱中放置20–30 min，粉碎后涂抹在分离培养基上用于分离放线菌[11]。
1.2.2 植物根际菌的分离：将采集的补血草根系除去表面浮土后轻轻抖动得到根际土壤。用无菌水溶解并进行梯度稀释后涂布于各分离培养基的平板上，37 °C进行培养。
1.3 ACC脱氨酶活性菌株的筛选1.3.1 ACC脱氨酶定性检测：将菌株接种于ADF固体平板，连续传代5次后仍能够在该培养基上正常生长则证明该菌株具有产ACC脱氨酶的能力。1.3.2 ACC脱氨酶定量检测：将筛选得到的产ACC脱氨酶的细菌、放线菌分别接种于NA和ISP 2液体培养基中摇床(28 °C、200 r/min)培养3–7 d，将纯培养得到的菌体用不含(NH4)2SO4的DF培养液冲洗，然后在4 °C条件下用转速5000 r/min离心10 min，之后收集菌体，重复3次，用液体ADF重悬，摇床(28 °C、200 r/min)暗培养7 d以诱导产生ACC脱氨酶。低温离心收集菌体，用0.1 mol/LTris-HCl缓冲液(pH 7.6)洗涤离心2次，重悬浮于600 μL 0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)中，在液氮中快速冷冻1 min，迅速放入25 °C水浴5 min，重复3次，然后再分别加入30 μL甲苯并迅速振荡30 s以破碎细胞。按照Honma等[12]和Saleh等[13]的步骤做ACC脱氨酶活性的测定，于540 nm测其吸光度。每组实验重复3次，用重蒸水作为空白对照。每分钟形成1 μmol α-丁酮酸的活性作为ACC脱氨酶的单位酶活，并用Bradford比色法测定酶蛋白浓度[14]。
1.4 菌株产IAA能力检测
1.4.1 产IAA定性检测：参照Salkowski比色法[15]，在含有色氨酸的培养基中培养7 d后与显色剂混匀，室温显色2 min，如果出现粉红色则为阳性，说明能够产生IAA。
1.4.2 产IAA定量检测：将菌株接种于无菌的有氮培养基(含0.5 mg/mL色氨酸)中28 °C摇床培养7 d (不接菌的作为对照)，4000 r/min离心，取上清溶液于试管中加入等体积的RI试剂，混匀后避光放置30 min，530 nm波长条件下测定其OD值。通过IAA浓度与OD值得关系曲线计算相应的IAA浓度。
1.5 菌株溶磷能力检测将菌株点接于无机磷培养基上，放线菌于28 °C、细菌于37 °C培养箱中培养3–8 d后观察是否有溶磷圈。
1.6 菌株固氮能力检测将菌株点接到无氮培养基上，放线菌于28 °C、细菌于37 °C培养箱中培养3–8 d，转接5次后仍能正常生长的菌株视为有固氮活性
。1.7 菌株耐盐性检测将菌株点接到不同盐浓度(0–30% NaCl，1%浓度递增)的固体平板上，放线菌于28 °C培养7 d、细菌于37 °C培养箱培养3 d之后。观察生长情况并进行统计。
1.8 菌株16S rRNA基因序列的测定以及系统发育分析将产ACC脱氨酶活性的菌株纯化后提取基因组DNA，细菌通用引物对27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′用于16 S rRNA基因的PCR扩增。PCR反应体系(50 μL)：DNA 2 μL，10×buffer 5 μL，MgCl2(25 mmol/L) 3 μL，dNTPs(10 mmol/L) 1 μL，引物27F (10 μmol/L) 1 μL，引物1492R (10 μmol/L) 1 μL，Taq酶(5 U/μL) 0.5 μL；PCR反应程序：94 °C 5 min；94 °C 1 min，55 °C1 min，72 °C 2 min，35个循环；72 °C 5 min；反应完后用1%的琼脂糖凝胶进行检测。PCR产物送至生工生物工程(上海)有限公司测序。根据测序结果，利用NCBI中的BLAST以及EzBioCloud数据库进行序列比对，调出相似性较高的相关菌株的16S rRNA基因序列，然后分别通过Clustal X 1.8及MEGA 5.0软件进行序列比对及分析，最后用邻接法(Neighbor-Joining，NJ)构建系统进化树并进行系统发育分析。2 结果和分析2.1 菌株分离本研究采用海藻糖-脯氨酸培养基、NA培养基、R2A培养基、1/5 ISP 2培养基、TWYE改良培养基和KMB-金氏培养基等多种培养基，经过初筛去重复从中华补血草植物叶片、根和根际土壤共获得168株菌。2.2 菌株ACC脱氨酶活性测定结果以分离得到的内生及根际细菌作为供试菌株，并以ACC脱氨酶为指标进行初级定性筛选。经多次传代后有18株菌仍然能够在ADF固体平板上正常生长，说明他们具有ACC脱氨酶活性。活性菌株中有5株为根内生菌，3株为叶内生菌，10株为根际细菌。进一步的酶活定量结果显示有13株菌的ACC脱氨酶含量在20 nmol α-KA/(mgPr•h)以上(表1)。其中KLBMP 4978、KLBMP5180、KLBMP 5140、KLBMP 5116及KLBMP5315的ACC脱氨酶活性较高，活性最高的菌株是KLBMP 5315和KLBMP 5180，酶活分别为149.26μmol α-KA/(mg Pr•h)和147.59 μmol α-KA/(mg Pr•h)。
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