3）结实率统计：将收回单株烘干后统计每穗的饱粒数和瘪粒数，计算每穗结实率（饱粒数/总粒数×100%），然后取其平均值作为单株结实率。

1.2.3  构建极端混池

1.2.3.1  DNA提取叶片选择

在分离家系中选择12个结实率最高的单株和12个结实率最低的单株，取其对应编号的叶片。

1.2.3.2  水稻叶片DNA提取

DNA提取采用CATB提取法

1）根据表1配制CATB液

表 1 CATB 液配方

试剂 用量

CATB 20 g

NaCL 81.82 g

Tris-HCL 12.14 g

EDTA 7.45 g

         ddH2O 室温定容1000 mL，PH调节为8.0

2）具体步骤如下：

A.将水稻叶片剪碎放置于2 mL的Eppendorr管中，同时放入一颗事先洗净直径3 mm的玻璃珠在Eppendorr管里中。将装有样品Eppendorr管放在磨样盒里面，倒入液氮冷冻3 min，然后放在磨样机上磨样，时间40 s；

B.加入0.65 mL的CATB提取液，并将管盖压实。颠倒摇匀后放于65℃烘箱中30 min，每隔10 min颠倒摇匀一次；

C.30 min后，将管取出。加入0.5 mL氯仿/异戊醇（24:1），颠倒摇匀后再次放在65℃烘箱中10 min，每隔5 min颠倒摇匀一次；

D.10 min后将管取出12000 rpm离心8 min。取上清液于新的1.5 mL Eppendorf管中，加0.5 mL异丙醇，混匀后于-20℃冰箱静置30 min以上；

E.30 min后取出，12000 rpm离心8 min；

F.弃上清液，加入0.5 mL 70%乙醇，静置5 min；

G.1200 rpm离心1 min，缓慢倒掉乙醇，置于室温自然晾干；

H.加入适量ddH2O，-20℃保存备用。

1.2.4 引物设计

本次实验所用的引物为SSR标记，SSR标记从本实验室保存的2000多对公开发表的引物中挑选，引物信息和序列参照GRAMENE合成。引物设计软件选用Primer Premier 5.0，设计的引物长度在22bp左右，GC含量在40%～60%。