生菜再生体系的建立+文献综述(2)
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1生菜种子
试验中的美国生菜，香港生菜，法国生菜，玻璃生菜，紫色生菜的种子均购自周口市农科院。
1.1.2试剂
75%乙醇，0.1%HgCl2溶液，蒸馏水，MS培养基各组成成分，吲哚乙酸，6-苄氨基腺嘌呤，氢氧化钠，琼脂等。
1.1.3仪器设备
超净工作台、精密电子天平、1L的容量瓶、培养皿、镊子、解剖刀、酒精灯等。
1.2方法
1.2.1无菌苗的培养
①将种子用75%酒精处理30s，无菌水冲洗4～5次，然后用0.1%HgCl2溶液浸泡10min，经表面的消毒和用无菌水冲洗7～8次后。
②接种前，用75%酒精擦拭超净工作台，将接种工具放入超净工作台，房间用酒精喷雾降尘后打开超净工作台紫外灯，照射约20min，然后关闭紫外灯打开换气扇，通风20min后即可进行接种工作[3,4]。
③外植体消毒，用75%酒精处理30s，无菌水冲洗4～5次，然后用0.1%HgCl2溶液浸泡10min，经表面消毒和用无菌水冲洗7～8次。
④接种，先用酒精喷雾器清洗双手及待接种的培养基，左手拿培养基，在酒精灯上方取掉棉塞，然后右手拿镊子，从消毒好的广口瓶中取生菜种子，一个培养集中接5～6个，然后再酒精灯上方慢慢塞上棉塞，至三瓶接种完后，将实验器具放入75%乙醇中浸泡，然后取出接好的培养基，包扎标号。在温室里培养20d，当真叶达到4cm时，可以用这些无菌苗做实验材料[5]。
1.2.2生菜子叶愈伤组织的建立
①培养基制备，具体方法同MS培养基制备相同，但该培养基中还需加入生长激素6–BA和IAA，五种培养基的浓度梯度按表1配制，每个品种生菜设置3个重复。
表1 五种诱导生菜愈伤组织的培养基
培养基代号 成分
MS1 MS+0.1mg/ L-6-BA+0.6mg/ L IAA
MS2 MS+0.15mg/ L-6-BA+0.8mg/ L IAA
MS3 MS+0.3mg/ L-6-BA+1.4mg/ L IAA
MS4 MS+0.25mg/ L-6-BA+1.2mg/ L IAA
MS5 MS+0.2mg/ L-6-BA+1.0mg/ L IAA
②接种前，用75%酒精擦拭超净工作台，将接种工具放入超净工作台，房间用酒精喷雾降尘后打开超净工作台紫外灯，照射约30min，然后关闭紫外灯打开换气扇，通风20min后即可进行接种工作[6,7]。
③接种，先用酒精喷雾器清洗双手、待接种的培养基及含有无菌植物的兰花瓶，叶片大小适中，一个培养基上接4～5片，接上后，要用镊子将叶片的边缘刮出少许伤口，有利于产生愈伤，按照之前规定的浓度依次接种到不同的培养基中。
④接种完毕后，将实验器具放入75%乙醇中消毒，取出接种好的培养基，包扎、编号，先在黑暗的条件下处理2d，之后移动到培养架上，在22℃，光照强度2 000 lx，光照长度16 h/d，两周后进行统计分化频率，分析实验结果[8]。
2结果与分析
2.1不同培养基对某一特定品种（美国）生菜子叶愈伤组织诱导率的影响
试验采用MS作为基本培养基，选用无菌培养的生菜子叶作为外植体，研究了IAA和6-BA共同作用对生菜子叶愈伤组织诱导效果。试验表明，美国生菜的子叶具有很高的脱分化和再分化能力，接种两周后，所有培养基上的大多数外植体在子叶切口端产生明显可见的愈伤组织，其中愈伤诱导率最高的培养基为MS5培养基。五组的出愈率分别是MS1为86% ，MS2为73%，MS3为66%，MS4为80%，MS5为93%。如图1所示。