摘要：银杏作为江苏省的省树，不仅具有较好的观赏性，而且其所含有的主要活性物质，如银杏黄酮类化合物、银杏萜内酯类化合物等，具有强大的药用功效和较高的经济价值。但银杏叶中活性成分含量低，且受环境影响较大。植物干细胞是生长发育的源泉和信号调控中心，所含的活性成分含量远高于愈伤组织细胞，且细胞均一稳定，为天然产物的商业化生产提供新的研究方向。本研究诱导出了银杏愈伤样组织，通过中性红染色及显微观察证实该愈伤样组织即为银杏干细胞。在此基础上建立了银杏干细胞培养体系。同时本研究建立了银杏内酯A、B、C和白果内酯的高效液相-蒸发光散射器的检测方法，四种化合物在同一条件下可在不同时间出峰。该检测方法可为后续检测银杏干细胞培养体系中的活性物质所用。本研究可为后续利用银杏干细胞生产活性物质奠定基础。80351

关键词：银杏、银杏内酯、植物干细胞、银杏干细胞培养体系

Establishment of stem cell culture system of Ginkgo biloba and detection of active substance

Abstract:Ginkgo biloba as provincial tree of Jiangsu Province, not only has good ornamental, but also has a strong medicinal effect and high economic value, as it contains many active substances, such as flavonoids compounds, terpenoids, and so on。 However, active components in Ginkgo biloba leaves are lower and greatly affected by environment。 Plant stem cell is the source of growth and development and the signal control center, containing the active ingredient content is much higher than that of callus cells, and the cells are uniform and stable for natural products business production which provides a new research direction。 In this study we induced callus analogus, and through dyed with neutral red, and microscopic examination, we can confirm that this callus analogus was stem cells of Ginkgo biloba。 We established the culture system of stem cell of Ginkgo biloba。 At the same time we established the method of detection Ginkgolides A、B、C and Bilobalides used HPLC-ELSD。 These four compounds have different retention times under the same conditions。 We will use this method to detect the active content in stem cell culture system。of Ginkgo biloba, and this study will be the basis of futher production active substance from stem culture system of Ginkgo biloba。

Keywords: Ginkgo biloba; Ginkgolides; plant stem cells; stem cell culture system   

目录

前言 1

1材料与方法 2

1。1外植体的选取与处理 2

1。2实验器具 2

1。3试剂 2

1。4银杏干细胞培养基配制 2

1。5银杏枝条的灭菌处理 2

1。6银杏干细胞诱导 3

1。7干细胞显微观察 3

1。8银杏干细胞液体培养体系建立 3

1。9银杏内酯检测方法的建立 3

2 结果与分析 3

2。1 干细胞的诱导和继代培养 3

2。2 干细胞的显微观察 4

2。3 银杏活性物质检测方法的建立 5

3讨论 6

4致谢 7

参考文献 8银杏是银杏科银杏属植物，又名白果树或是公孙树。是地球上生存最久的植物之一，素有天然活化石之称。银杏作为江苏省的省树，不仅有较高的观赏价值，其药效作用也是十分强大。银杏产业在徐州邳州更是具有特殊地位。在银杏中所含的银杏内酯类化合物，是仅存在于银杏细胞中的一类化合物，这类化合物是血小板活化因子PAF强有力的拮抗物，具有改善血液流变状态，保护心脑，防治冠心病，脑血栓等药理作用。银杏内酯现已发现多种，其中以银杏内酯A，银杏内酯B，银杏内酯C和白果内酯4种为主，它们的结构已经被确定。但是天然植物生长周期缓慢，并且活性成分的含量很低，即便采取化学合成的方法也很难实现这些化合物原材料的供应，因为许多次生代谢产物化学结构非常复杂和独特，涉及到的生物合成途径繁锁，而且合成过程中，花费的成本比较高。使之难以适应现代化工业化大生产的需求。[1]在此问题上，人们发现了植物干细胞的诸多特性，试图利用这些特性诱导出大量活性物质。80351

植物干细胞又称之为分生组织，是植物体内未分化,尚不成熟的特殊细胞。[2]植物干细胞是植物生长发育的源动力和信号调控中心，具有很强的持续分裂能力。[3-4]植物干细胞技术是利用干细胞生长和遗传特性的优点，在传统细胞培养上，以植物干细胞为目标，诱导、分离和培养外植体，建立稳定的干细胞培养体系。[5]植物干细胞培养技术使得植物干细胞不仅生长速度快、性状稳定，因为细胞具有游离生长、液泡分散的特性，培养体系对各种类型（搅拌桨式、气升式）、各种规格的生物反应器都具有良好的适应性，而且具备了商业化生产的条件。[6]

目前银杏内酯主要从银杏叶和根皮中提取，但提取得率不高，而且受环境影响很大。目前，韩国的Unhwa公司一手掌握着植物干细胞培养的核心技术，但是由于商业竞争和保护知识产权等等一些因素，植物干细胞培养技术的广泛应用还需要时间。另外，这种技术本身存在的一系列问题也急需进一步完善。拿报道和研究材料最充分的红豆杉来说，[7]在没有经过诱导的干细胞体系中，红豆杉中的活性物质——紫杉醇，是几乎不存在的。但当经过诱导后，细胞是否还保持干细胞特性，并没有进行相关研究。而在银杏研究方面，目前还没有银杏干细胞的研究。目前银杏活性产物都是从银杏叶中提取。影响银杏活性物质含量的因素比较多，如产地，季节，树龄，器官等。在对于银杏内酯类活性物质的检测中，最常用的检测方法无疑是高效液相色谱法。[8-9]因为银杏内酯对紫外光是低吸收的，而且银杏中存在有黄酮类物质的干扰，且这种干扰性比较大，因此不适合使用紫外检测器进行检测。由此，蒸发激光散射检测器因为选择灵敏度高，选择性好等特点被我们用来检测银杏中活性物质。[10]

本研究旨在建立稳定的银杏干细胞培养体系，摸索条件建立银杏内酯A、B、C和白果内酯的检测方法，本研究可为后续利用银杏干细胞生产活性物质奠定基础。

1材料与方法

1。1外植体的选取与处理论文网

以银杏新生枝条（取自大学玉泉河畔）作为外植体，将枝条先用自来水冲洗干净，然后超声清洗20min，再自来水冲洗2h，洗去附着在表面的杂菌。

1。2实验器具

1000μl移液枪，电子天平，高压灭菌锅，无菌操作台，250ml锥形瓶，1000ml锥形瓶，滤头，5ml注射器，手术刀，镊子，酒精灯，组培接种洁净高温消毒器，滤纸，高效液相色谱仪，光学显微镜

1。3试剂

硝酸钾、七水硫酸镁、七水硫酸锰、七水硫酸锌、五水硫酸铜、二水氯化钙、碘化钾、六水氯化钴、二水磷酸二氢钠、硼酸、二水钼酸钠、乙二胺四乙酸铁钠盐、蔗糖、乙醇、升汞都为分析纯，甲醇为色谱纯。肌醇、维生素B1、烟酸、维生素B6、甘氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、精氨酸、毒莠定、结冷胶、活性炭、赤霉酸、抗坏血酸、柠檬酸和中性红购自上海生工。银杏内酯A、B、C和白果内酯标准品购自上海源叶生物科技有限公司。