图2细胞中性红染色图(A和B为银杏干细胞的染色形态。C为银杏的愈伤细胞染色形态)

Fig。2Cellsstainedbyneutralred(AandBarestemcells。Ciscalluscell)

2。3银杏活性物质检测方法的建立

为了后续银杏干细胞活性物质的检测,我们建立了银杏活性物质检测的方法。首先将银杏内酯A、B、C和白果内酯用甲醇配制成标准溶液,然后根据文献的方法进高效液相-蒸发光散射器检测,结果银杏内酯C和白果内酯在相同时间出峰。为了将这两种物质分开,我们摸索了流动相甲醇和水的比例,结果在甲醇和水比例为35。5:64。5时,可将这两种物质完全分离。在此基础上,将这四种标准品配制在一起用上面的方法进行检测,结果获得完全不同出峰时间的谱图(图3)。该方法的建立可为后续银杏干细胞培养体系中活性物质的检测所用。

图3银杏内酯A,B,C和白果内酯的高效液相色谱图

Fig。3GinkgolidesA,B,CandbilobalidesanalysedbyHPLC

1:白果内酯;2:银杏内酯C;3:银杏内酯A;4:银杏内酯B

3讨论

本研究以银杏的当年生枝条为外植体,表面灭菌后,用锋利刀片将形成层、韧皮部、皮层的组织与木质部分开,形成层面朝上放置,在干细胞诱导培养基上培养,培养八周后,形成层组织膨大生长,与脱分化的愈伤组织分层,将形成层干细胞层转移到生长培养基上培养。本方法目前已经被银杏成功应用到干细胞培养体系的建立中[11]

在培养时,常会遇到污染问题,一开始则是由于操作不当。当规范操作后,少部分银杏外植体依然会污染,即发现是内生菌的污染现象,由此,当重新对外植体培养之前,对银杏枝条进行预处理,即用干净手术刀轻轻刮除外表皮后再进行灭菌处理。这种操作则大大降低了污染率,使得实验能够有效率地进行。

在对银杏枝条灭菌处理时,要严格把握灭菌时间,即水洗后,75%酒精处理30秒,再次水洗,0。1%升汞处理10分钟后水洗。如果灭菌处理时间不够,则导致诱导的干细胞被污染。如果灭菌处理时间过长,则会杀死银杏细胞,结果是诱导不出干细胞。

当在固体培养基培养至一定时间后,转入液体悬浮培养时,由于培养基灭菌不彻底,培养的一批全都污染了,因此再操作时需要注意的部分较多。比如培养基灭菌要彻底,但是培养基灭菌时间太长也不行。干细胞在固体培养时是以细胞团存在的,而液体培养时干细胞基本都以单细胞形式存在,因此需要用镊子将干细胞团捏碎,还需要过细胞筛,过筛也需要严谨的无菌操作,目前已经培养了大量的固体培养干细胞,下面可以再次进行液体悬浮培养。

因为银杏内酯对紫外光是低吸收的,而且银杏中存在有黄酮类物质的干扰,且这种干扰性比较大,因此不适合使用紫外检测器进行检测。所以可以选择灵敏度高,选择性好的蒸发激光散射检测器,对银杏内酯类活性物质进行检测。当银杏内酯A、B、C和白果内酯用甲醇配制成标准溶液,然后根据文献的方法进高效液相-蒸发光散射器检测时,因为银杏内酯C和白果内酯在相同时间出峰,所以不得不摸索出条件,使得银杏内酯C与白果内酯可以分开出峰。摸索了流动相甲醇和水的比例,结果在甲醇和水比例为35。5:64。5时,可将这两种物质完全分离,使得四种活性物质可以在一张谱图上分开出峰。该方法的建立,使得测定更为准确,方法通用性好,适合常规检测,对于后续银杏干细胞活性物质的测定提供便利的检测方法。

植物干细胞培养技术是植物细胞培养的新方向。干细胞相对于愈伤细胞遗传稳定,耐剪切,可应对传统细胞培养时所遇到的一系列问题。目前,植物干细胞培养技术还存在许多不足之处。不同的植物,干细胞的建立方法也不同,另外可能需要的培养基组分也不一样。但干细胞的巨大优势将推进植物干细胞的研究,从而推动与之相关的食品、医药和化妆品等行业的发展。

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