图3-1 D1菌株的总DNA 10

图3-2 质粒提取检测 10

图3-3 D1菌株基因圈图 11

图3-4 4586-4638基因簇的物理图谱 11

图3-5 4587基因的氨基酸序列进化树 12

图3-6 pCold I质粒图 13

图3-7 目的基因的PCR产物 14

图3-8 酶切后质粒图 15

图3-9 未酶切质粒图 15

表清单

表序号 表名称 页码

表2-1 使用仪器名称目录 5

表2-2 PCR反应条件 7

表2-3 载体线性化处理条件 8

表2-4 连接体系以及条件 8

表3-1 引物图 13

1引言

Bacillus sp. D1是一株以香草酸(Vanillate)为唯一碳源从高温堆肥环境中分离的嗜热性芽孢杆菌(Thermophilic Bacillus sp.)，生长温度范围在是50−70 ºC，最适生长温度为55 ºC。相比于已报道的降解菌株，D1菌株有一个显著的优点，降解谱广，除香草酸外，唯一碳源和能源也可以是肉桂酸(Cinnamic acid)、阿魏酸(Ferulic acid)、对羟基肉桂酸(p-Coumarate)、苯甲酸、对羟基苯甲酸等。彭学等[1]初步阐明了这些代谢途径。当把对羟基苯甲酸作为唯一碳源和能源培养菌株时，在培养基中积累了龙胆酸(Gentisate)，证明了对羟基苯甲酸的代谢是通过龙胆酸开环途径降解的。

对羟基苯甲酸(p-hydroxybenzoate )是一种可以消融于乙醚和丙酮等有机溶剂的无色、结晶状粉末，在中性前提下微溶于水。严兵等[2]研究发现，在日常生活中，对羟基苯甲酸也有着广泛的用途，可以作为食品添加剂，也可以用于医药、化妆品的防腐以及生产液晶聚合物等方面。对羟基苯甲酸还是木质素降解的重要中间产物。自然界中，由于环境微生物降解作用，对羟基苯甲酸不会大量累积。

Bais HP [3]、Li HH [4]研究证明了从二十世纪中期开始，由于社会发展的需要，增加了对石化产品的需求，人类大量使用含有芳香环的石化产品，因此人工化合物的积累速度超出了大自然对其的净化速度，而这些人工化合物降解的主要中间代谢产物正是对羟基苯甲酸 [5]，从而使对羟基苯甲酸累积加剧，成为常见的环境污染物。大量的对羟基苯甲酸的积累抑制了农作物和植物的成长，导致农林作物产量减少以及自然生态环境的毁坏。因此，环境微生物研究者长期以来一直在关注对羟基苯甲酸的降解研究。一方面，降解途径的研究方便使我们更深层次理解碳元素循环在自然界中的过程，另一方面，也有利于对环境的改善。 

常见的降解对羟基苯甲酸的途径有三种：原儿茶酸开环途径[6]（如图1-1），脱碳酸途径[7]（如图1-2），和苯甲酰-CoA还原途径[8]（如图1-3），现发现还有一个NIH重排反应参与的龙胆酸降解途径（如图1-4）。该途径的反应机制尚未明确，本研究将从基因水平研究对羟基苯甲酸的龙胆酸降解途径。从基因组分析，基因簇分析，双加氧酶基因的克隆方面进行实验。