2  材料与方法  2.1 实验材料 本论文的实验选用了两个甘薯品种,分别是徐薯 22 和徐薯食 5(河南省农业品种鉴定,2015),两个甘薯品种是由国家甘薯研究中心(江苏,徐州,徐州农科院)提供。2.2 植物培养与处理 挑选选取发育健康、大小一致,长势接近的徐薯 22 和徐薯食 5 样本茎蔓各30 棵进行水培生根。 待徐薯 22 和徐薯食 5 样本发根 5 天后,进行选取发育健康、茎蔓大小合适(20 cm)、长势形态接近(叶片数量约为 8-10片)、根系长度接近(长度约3-5 cm)的不定根期甘薯幼苗各 20棵, 移植到改良霍格兰培养液中(1/4 浓度,含有 2.5 mM NO3-和0.5 mM NH4+)。培养条件为光照16 h/8 h, 温度28℃/26℃,光照强度为 150 umol m-2 s-1。将营养液每两天更换一次,并利用气泵进行充氧以保持培养液中的氧气含量大于 5 mg/L。将徐薯22 和徐薯食 5样本培养10天后,选取根系大小合适、发育健康(根系长度 10 cm 左右),长势接近的徐薯22,徐薯食 5样本不定根期幼苗各 12棵,随机选取样本并分别设置为 2 组处理,每组 6 棵幼苗样本。将 4 组处理的徐薯 22,徐薯食 5 样本分别设置为对照组徐薯食 5、100 mM NaCl 盐处理组徐薯食5和对照组徐薯22、100 mM NaCl 盐处理组徐薯 22。 其中对照组的甘薯食 5和徐薯22样本始终用改良霍格兰溶液培养,盐处理则在改良霍格兰溶液中加入 100 mM 的 NaCl,培养条件与上面相同。在100 mM NaCl 处理的徐薯22,徐薯食 5不定根期样本和对照组样本培养 2天后,采集甘薯幼根样品组织并进行 RNA提取和进行荧光定量 PCR实验进行研究。在选取合适材料进行实验时,根系则选取根尖处往上 0-4  cm 的所有根组织。徐薯 22,徐薯食 5 不定根期样本材料使用和保存:鲜样立即使用或用铝箔进行分装并做好标记,将徐薯食 5 和徐薯 22 样品放入到存有液氮的瓶中迅速的急冻,之后将样品放入-80℃冰箱中防止样品 RNA降解。
2.3 实验方法 
 2.3.1 RNA提取 称取约 0.1 g的甘薯样品根组织,迅速使用液氮进行研磨成粉末,然后加入1 mL的Trizol试剂,盖紧盖子,充分剧烈振荡15 s混合均匀,于室温静置2-3 min。之后加入0.2 mL氯仿,振荡后于4 ℃  10000 rpm离心15 min。离心后样品分层,下层的有机相是含有蛋白和 DNA,上层水相是含有 RNA。取上清,加入 0.5 mL异丙醇,轻轻混匀,放置到室温中静置 10  min 后,看看在管底是否会显示出胶状的沉淀,如果有,即为 RNA。4℃  10000 rpm 离心10 min 后弃去上清。向所得的沉淀中加入1 mL 75%的乙醇,轻轻混合均匀。4℃  10000 rpm 离心5 min 后弃上清。最后加入1 mL用无水乙醇清洗,10000 rpm 离心1 min 后弃上清,在超净台吹干,最后加入30 μL无RNase水溶解。以上操作步骤除了研磨甘薯样品和滴加SL是在普通试验台工作环境之外,其余的操作步骤均在超净工作台和在冰浴中进行。
2.3.2 RNA检测 浓度检测:使用 Nanodrop 2000检测RNA的浓度。 质量检测:把 4 μL RNA 和1 μL loading Buffer 核酸染料混匀源!自`优尔'文"论/文`网[www.youerw.com,  2-4 min 后使用1%的琼脂糖凝胶进行电泳分离,并用 5  μL的Marker作为参照,180 V 电泳10 min 后取胶拍照。 2.3.3 反转录 甘薯样品的RNA利用反转录试剂盒进行反转录,每个RNA样品反转4管,每管的反转录体系为 20 μL体系,每管的甘薯样品 RNA总量约为2000 ng,样品RNA 浓度均为 100 ng/μL。其中每管的 RNA 样品反转录体系中 4  μL 的 5*RT Buffer,1 μL的RT Enzyme Mix,1 μL 的dNTPs(10mM,each),1 μL的Oligo(dT) 15 (50 μM),1 μL的模板样品 RNA,
12 μL的Rnase free ddH2O,在进行第一链合成反应的条件是在温度为 50℃的条件下,进行 45 min,在温度为85℃的条件下,进行 5  min。此次甘薯样品 RNA 反转录在加样的过程中均在冰浴和超净工作台上进行,防止甘薯样品 RNA样品被污染。 2.3.4 PCR体系和程序 普通 PCR 和qPCR 扩增程序相同,只是PCR mix 不同,前者使用的 mix 为2x Es Taq MasterMix,后者使用的 mix 为UltraSYBR Mixture。反应体系(20 μL)如下: 2x mix 10 μL, Forward Primer (10 μM) 0.5 μL, Reverse Primer (10 μM) 0.5 μL,Template DNA (cDNA) 1.5 μL,RNase-Free Water 7.5 μL。 把 Mix,引物和水混合,然后加入 cDNA(cDNA 原液稀释 10 倍后使用)至20 μL,混匀后离心。设置程序为: 预变性的温度设置为 95 ℃,时间为 10 min,循环数为1;变性的温度设置为 95 ℃,时间为 15 S,循环数为40;退火和延伸的温度设置为 60 ℃,时间为 1 min,循环数为 40;溶解段的温度设置有 3个,分别为95℃时间为15 S、 60 ℃时间为1 min、 95 ℃时间为15 S,循环数均为 1。
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