可降解木质素的盐单胞菌菌株YC的分离与鉴定(2)
2.1.1样品采集： 用已灭菌的塑料瓶取海拔 0米，东经 119.25°北纬24.13°的东海海水。 2.1.2培养基： Solution A: 22.79 g 氯化钠，3.98 g 硫酸钠，0.72 g 氯化钾，0.27 g 氯化铵，47.2 mg 磷酸氢二钠，83 mg 溴化钠，31 mg 碳酸氢钠，27 mg硼酸，2.6 mg氟化钠，
1.3 g TAPSO， 890 ml 蒸馏水，调节 PH至7.6，高温高压灭菌； Solution B：11.18 g 六水合氯化镁，1.46 g 二水和氯化钙，24 mg 六水合氯化锶，100 ml 蒸馏水，高温高压灭菌；Solution C:0.02 g 四水合四氯化铁，100 ml 蒸馏水，G6玻璃砂漏斗过滤灭菌[7]；海水无机液体培养基：890 ml Solution A，100 毫升 Solution B，10ml Solution C；海水营养液体培养基：890 ml Solution A，100 毫升 Solution B，10 ml Solution C，2 g/L 胰蛋白胨，1 g/L 酵母提取物；海水营养固体培养基：890 ml Solution A，100 ml Solution B，10 ml Solution C，2 g/L 胰蛋白胨，1 g/L 酵母提取物，2%琼脂粉。 2.1.3其他仪器与试剂： 高压蒸汽灭菌锅；摇床；离心机；PCR 仪；冰箱；恒温培养箱；显微镜；凝胶成像仪；超净台；琼脂糖；上海生工 PCR 扩增试剂盒；API 20NE标准比色卡（含附加试剂）；路哥尔氏（Lugol）碘液；草酸铵结晶紫染液；95%乙醇；番红染液；EB染液；香柏油；50X TAE Buffer: Tris 242 g ，二水合乙二胺四乙酸二钠37.2 g， 57.1 ml 冰乙酸，源!自`优尔'文"论/文`网[www.youerw.com调节PH至8.3，去离子水(ddH2O)加至1升。
2.2菌的分离培养 取采集样品1mL于Eppendoff离心管中；加入无菌水对原液进行梯度稀释，将样本稀释成多个浓度梯度，再将不同浓度梯度的菌液各取 1mL 于海水营养固体培养基一天，观察菌落生成情况并筛选单菌落。培养条件是将平板置于30℃的培养箱中。稀释的浓度梯度如下： 序号 1 2 3 4 5 稀释梯度 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 2.3 菌株的富集与纯化筛选 挑取单菌落与木质素作为唯一碳源的富集培养基中，静置于 30℃的生化培箱中培养。间隔 24小时观察菌落生长情况并作相应记录，筛选出能降解木质素的菌种。 待富集培养基长出菌落后即可挑取菌落与木质素无机盐培养基中进行纯化培养直至只有单菌落为止。 2.4 YC菌株的鉴定 2.4.1 用菌落 PCR法对 YC菌株的 16S rDNA序列进行扩增： 挑取平板上的单菌落配制成菌悬液，用加热煮沸法破坏细菌的细胞壁，用上海生物工程有限公司的 PCR 扩增试剂盒对YC 菌株的16S rDNA 进行扩增， PCR试剂使用配方如下表 1 所示，其中上游引物为 Escherichia coli bases 8to27: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’, 下 游 引 物 为 Escherichia coli bases 1507to1492: 5’-TACCTTGTTACGACTT -3’ [11]。50微升体系PCR 试剂使用量与PCR 条件[12]如下表 2所示：
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