最初分离得到的Taq DNA聚合酶分子量大小为93909KDa,由832个氨基酸组成,含有7个结构域,比活性约为20万U/mg的纯化酶。如图1-2所示,287~832氨基酸之间是功能域,酶学分类:E.C1.7.7.7,含有5′→3′核酸外切酶活性。反应最适温度在75℃到80℃,95℃时的半衰期是40min,100℃时的半衰期是5min[28]。
 
图1-2 Taq DNA聚合酶的结构
Taq DNA聚合酶具有以下特点:①耐高温,TaqDNA酶在70℃高温下反应2h后其活性保持原来的90%以上,在93℃下热处理2h后其活性保持为原来的60%以上,95℃时酶活性半衰期为1.5h。②热稳定性。在热变性时酶活性不会被钝化,因此不必在每次PCR反应后另加新酶。③较高的扩增效率、灵敏度和特异性。
Taq DNA聚合酶具有5′→3′核酸外切酶活性,但没有3′→5′核酸外切酶活性,因此不具有3′→5′的校对活性。其错配率取决于dNTP的浓度,会在PCR反应的3′末端加上额外的非模板链的核苷酸,通常为dATP[29]。因此由Taq DNA聚合酶参与的PCR产物可以直接克隆到含有3′-T突出端的载体上。
1.3.3其他耐热DNA聚合酶
目前,已经发现了多种耐热性DNA聚合酶,并对它们进行了研究,同时,研究者还致力于修饰改造现有的DNA聚合酶,以获得更好地性能,从而提高PCR反应的产量和质量。目前,主要有从嗜热息热菌(T.thermophilus)中分离的Tth DNA聚合酶、从Litoralis栖热球菌(T.litoralis)中分离的Vent DNA聚合酶、从Pyrococcus furiosus中获得的Pfu DNA聚合酶以及修饰Taq DNA聚合酶等。现单就实验中所用的Pfu DNA聚合酶的特性简要概括一下。
Pfu DNA 聚合酶是从高温嗜热菌Pyrococcus furiosis 分离出的高保真(High Fidelity)耐高温DNA 聚合酶[30]。由于具有3′→5′的外切酶活性,Pfu能纠正DNA扩增过程中产生的错误,而传统的Taq DNA Polymerase,Tth DNA Polymerase 及它们的变体如Ampli Taq、Klen Taq等都不能。高温DNA聚合酶VenteepVent、Tli、Pwo、Pfu、Ultma等具有校正功能(Proof reading),但Pfu是目前已发现的所有耐热性DNA聚合酶中保真度最好的DNA 聚合酶,它在DNA扩增时出错率(error rate)最低,比Taq DNA Polymerase及其变体低10倍,比Vent和Pwo低2~4倍,比Ultma低30倍。其它高温DNA聚合酶与Pfu混合使用,可以部分降低产品的错误率,但是效果达不到单独使用Pfu时的高保真率[31]。
在基因克隆和表达,基因突变分析等现代分子生物操作中,若对DNA扩增产物的正确率要求特高,希望万无一失,Pfu DNA聚合酶是首选。但是,Pfu扩增效率通常比Taq酶差,这是因为Pfu酶具有3′→5′的外切酶活性,即在PCR反应中具有高保真性,而不是Pfu酶的活性不稳定。对于2.0kb以下的模板DNA片段的扩增,Pfu酶和Taq酶的扩增效果没有多大差别。
1.3.4耐热DNA聚合酶研究意义
耐热DNA聚合酶的使用大大地简化了PCR操作过程,扩大了PCR技术的应用范围。本课题是运用基因工程技术将从嗜热菌Thermus aquaticus中克隆获得Taq DNA聚合酶的基因进行蛋白融合及定点突变改造,并建立重组Taq酶的大肠杆菌高效表达体系,诱导表达、提取和纯化获得纯重组酶,并将其应用到不同的PCR体系中,从而验证重组酶的活性,进一步完善了新型的DNA聚合酶Taq的一般扩增方案。
随着DNA聚合酶研究的发展,PCR技术的应用范围也在不多的拓宽。怎样进一步改善耐热性DNA聚合酶的酶学性能,解决DNA聚合酶高效性与保真性之间的矛盾,已成为广大分子生物学研究者关注的热点。
其中,有研究表明将蛋白Sso7d的DNA结合域融合到DNA聚合酶中可以加快该酶在PCR中的延伸速率[32]。Sso7d蛋白是从嗜热硫化裂片菌(SµLfolobus solfataricus)中分离出的一种DNA结合蛋白,分子量为7kD,耐热性强(Tm>90℃),具有与dsDNA非特异性结合的特性。它大量存在于嗜热古细菌中,并对稳定基因组DNA中起着重要的意义。
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