几种高温DNA聚合酶性质比较+文献综述(4)
最初分离得到的Taq DNA聚合酶分子量大小为93909KDa，由832个氨基酸组成，含有7个结构域，比活性约为20万U/mg的纯化酶。如图1-2所示，287~832氨基酸之间是功能域，酶学分类：E.C1.7.7.7，含有5′→3′核酸外切酶活性。反应最适温度在75℃到80℃，95℃时的半衰期是40min，100℃时的半衰期是5min[28]。
图1-2 Taq DNA聚合酶的结构
Taq DNA聚合酶具有以下特点：①耐高温，TaqDNA酶在70℃高温下反应2h后其活性保持原来的90%以上，在93℃下热处理2h后其活性保持为原来的60%以上，95℃时酶活性半衰期为1.5h。②热稳定性。在热变性时酶活性不会被钝化，因此不必在每次PCR反应后另加新酶。③较高的扩增效率、灵敏度和特异性。
Taq DNA聚合酶具有5′→3′核酸外切酶活性，但没有3′→5′核酸外切酶活性，因此不具有3′→5′的校对活性。其错配率取决于dNTP的浓度，会在PCR反应的3′末端加上额外的非模板链的核苷酸，通常为dATP[29]。因此由Taq DNA聚合酶参与的PCR产物可以直接克隆到含有3′-T突出端的载体上。
1.3.3其他耐热DNA聚合酶
目前，已经发现了多种耐热性DNA聚合酶，并对它们进行了研究，同时，研究者还致力于修饰改造现有的DNA聚合酶，以获得更好地性能，从而提高PCR反应的产量和质量。目前，主要有从嗜热息热菌（T.thermophilus）中分离的Tth DNA聚合酶、从Litoralis栖热球菌（T.litoralis）中分离的Vent DNA聚合酶、从Pyrococcus furiosus中获得的Pfu DNA聚合酶以及修饰Taq DNA聚合酶等。现单就实验中所用的Pfu DNA聚合酶的特性简要概括一下。
Pfu DNA 聚合酶是从高温嗜热菌Pyrococcus furiosis 分离出的高保真（High Fidelity）耐高温DNA 聚合酶[30]。由于具有3′→5′的外切酶活性，Pfu能纠正DNA扩增过程中产生的错误，而传统的Taq DNA Polymerase，Tth DNA Polymerase 及它们的变体如Ampli Taq、Klen Taq等都不能。高温DNA聚合酶VenteepVent、Tli、Pwo、Pfu、Ultma等具有校正功能（Proof reading），但Pfu是目前已发现的所有耐热性DNA聚合酶中保真度最好的DNA 聚合酶，它在DNA扩增时出错率（error rate）最低，比Taq DNA Polymerase及其变体低10倍，比Vent和Pwo低2~4倍，比Ultma低30倍。其它高温DNA聚合酶与Pfu混合使用，可以部分降低产品的错误率，但是效果达不到单独使用Pfu时的高保真率[31]。
在基因克隆和表达，基因突变分析等现代分子生物操作中，若对DNA扩增产物的正确率要求特高，希望万无一失，Pfu DNA聚合酶是首选。但是，Pfu扩增效率通常比Taq酶差，这是因为Pfu酶具有3′→5′的外切酶活性，即在PCR反应中具有高保真性，而不是Pfu酶的活性不稳定。对于2.0kb以下的模板DNA片段的扩增，Pfu酶和Taq酶的扩增效果没有多大差别。
1.3.4耐热DNA聚合酶研究意义
耐热DNA聚合酶的使用大大地简化了PCR操作过程，扩大了PCR技术的应用范围。本课题是运用基因工程技术将从嗜热菌Thermus aquaticus中克隆获得Taq DNA聚合酶的基因进行蛋白融合及定点突变改造，并建立重组Taq酶的大肠杆菌高效表达体系，诱导表达、提取和纯化获得纯重组酶，并将其应用到不同的PCR体系中，从而验证重组酶的活性，进一步完善了新型的DNA聚合酶Taq的一般扩增方案。
随着DNA聚合酶研究的发展，PCR技术的应用范围也在不多的拓宽。怎样进一步改善耐热性DNA聚合酶的酶学性能，解决DNA聚合酶高效性与保真性之间的矛盾，已成为广大分子生物学研究者关注的热点。
其中，有研究表明将蛋白Sso7d的DNA结合域融合到DNA聚合酶中可以加快该酶在PCR中的延伸速率[32]。Sso7d蛋白是从嗜热硫化裂片菌（SµLfolobus solfataricus）中分离出的一种DNA结合蛋白，分子量为7kD，耐热性强（Tm>90℃），具有与dsDNA非特异性结合的特性。它大量存在于嗜热古细菌中，并对稳定基因组DNA中起着重要的意义。
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