图1-3 融合了Sso7d蛋白的DNA聚合酶的结构
如图1-3所示,融合了Sso7d蛋白后,在DNA复制时DNA聚合酶在模板上移动时获得了一个牢固的把手。因为将Sso7d以融合蛋白的形式与A族或B族的DNA聚合酶结合后,Sso7d蛋白对双链DNA具有较强的亲和力,可以识别PCR反应过程退火后的双链DNA,从而协助DNA聚合酶快速识别延伸的起点,极大的地增强了原DNA聚合酶的延伸速率[33]。此外,融合后的DNA聚合酶和双链DNA之间的作用也相对减弱,因此DNA聚合酶在DNA双链上移动的速度也相对加快。而且,经Sso7d蛋白融合修饰的聚合酶对于PCR抑制剂的抵抗能力得到了很大提升。
2 DNA聚合酶的提取与纯化
2.1  DNA聚合酶的提取
实验及工业生产中,从大肠杆菌中提取表达的酶蛋白,主要是通过细胞破碎技术,将胞内的蛋白释放出来。
细胞破碎技术[34]是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁,使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术,是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质的基础。目前,已发明了多种方法进行细胞破碎,以便适应不同类型和不同用途的细胞壁破碎。 破碎方法可规纳为机械法和非机械法两大类,机械法主要包括珠磨、高压匀浆、超声破碎及X-press法等,非机械法主要包括酶溶、化学渗透、冻结融化及干燥法等,各种方法的作用原理及适应性如表2-1所列。
表2-1 细胞破碎方法
分类    作用机理    适应性
珠磨    固体剪切
作用    较高的破碎率,可大规模操作;
大分子目的产物易失活,浆液分离困难
高压
匀浆    液体剪切
作用    较高的破碎率,可大规模操作;
不适于丝状菌和含有包涵体的基因工程菌
超声
破碎    液体剪切
作用    较高的破碎率,时间短,效率高,适于实验室和工业生产;
需要高能量,产生高温,引起产品变性失活,非专一性,分离困难
X-press    固体剪切    较高的破碎率,活性保留率高;浆液分离困难
酶溶    酶降解作用    专一性高,抽提速率和收率高,产品破坏少,不残留细胞碎片,
易于分离;但费用高,通用性差,不适于工业生产
化学
渗透    改变细胞膜
渗透性    有一定的选择性,不需要特殊设备,细胞外形保持完整,
细胞碎片少,利于后续分离;通用性差,时间长,
效率低,某些化学试剂有毒
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