水稻ABC1激酶ABC1K3的突变体分析(2)
2.2 强光处理 经过浸种和催芽后，并且已萌发的水稻野生型种子和突变体种子，被播种到装有土壤的小盆中， 然后一起被放入到人工气候箱 （PRX-600B） 中， 在26 ℃、 光量子强度为300 μmol m-2 s-2、14 小时光照和 70%相对湿度的条件下生长。四周大的幼苗被用于强光处理。强光处理在温室中进行。控制温度为26 ℃、光量子强度为800 μmol m-2 s-2、70%相对湿度，并且维持14小时光照。各材料共处理 9天，并连续拍照。光源由400 W和250 W的飞利浦金属卤素灯提供。
2.3 叶绿素含量测定 根据 Arnon的方法，在水稻抽穗期测定野生型和osabc1k3突变体的叶片叶绿素含量。使用722S分光光度计(INESA instrument)测定色素吸光度。 2.4 Real-time PCR 实验 采用 RNAsimple 总 RNA 提取试剂盒（天根）分离分蘖期突变体和野生型植株叶片总RNA，利用 Biophotometer 分光光度计（Eppendorf）检测 RNA 质量。1μg 总 RNA 利用FastQuant 反转录试剂盒 （天根） 进行第一链cDNA合成。 采用SYBR Green PCR Master Mix试剂盒（宝生物）在 ABI 7500 real-time PCR 系统上进行定量PCR分析。水稻Actin1基因作为内参，引物序列见表1。 表 1 本研究中所使用的引物 基因 序列 产物长度（bp） HPT CGCTTCGGGACAACCTCTA 214 CACTGCCTCCAGCAAACCA HST CTGTAATGGTGCCTGTGC 152 CAACGGGAAGAAGATGTATT MMT CCGCAGCGAGGAATCAAG 253 CCGTCACAGAGCATCCCATA TC AGAAATGATGGTGGCAAGG 178 GAAATGGGATAGGGAAGAGG Actin1 CCCCTCCTGAAAGGAAGTA 148 GGTCCGAAGAATTAGAAGCA 3 结果与分析 3.1 osabc1k3 突变体表型分析 为了进一步研究水稻 ABC1 基因的分子功能，从水稻 T-DNA 插入序列数据库（http://signal.salk.edu/cgi-bin/RiceGE）中获得 OsABC1K3 基因的 T-DNA 插入突变体。于2013年正季将水稻的突变体和野生型材料种植到淮阴师范学院生物科技园中。 田间种植的突变体植株株高显著矮于野生型(图 1A，图 1B)、育性显著低于野生型（图 1A）。进一步测得植株叶片叶绿素含量， 发现osabc1k3突变体叶片的总叶绿素含量显著低于野生型对照3.2 osabc1k3 突变体对强光处理更加敏感 现已有研究表明 ABC1激酶指导着叶绿体对强光胁迫的应答和类异戊二烯酯的代谢。为了进一步研究OsABC1K3基因的分子功能，我们对本研究中的突变体植株和野生型对照进行了强光处理。处理7天以后，野生型和突变体的叶片均出现黄化，而突变体植株的叶片黄化更加严重，部分叶片枯死。处理9天以后，突变体植株的老叶几乎完全枯死，而野生型仍保持旺盛生长的活力（图2） 。这些结果表明，osabc1k3突变体植株对强光处理更加敏感。