醇脱氢酶的提取与纯化+文献综述(5)
需要对细胞进行破碎将酶释放出来，为酶的进一步分离纯化提供物质基础。破碎细胞
时，常用的破碎方法有以下几种：
⑴.高压匀浆法：碰撞以及由高压到常压的变化从而造成细胞的破碎；
⑵.高速珠磨法：微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂在搅拌浆作用下充分混合,珠
子之间以及珠子和细胞之间和互相剪切、碰撞，促使细胞壁破碎，释出内容物；
⑶.超声波破碎法：频高于 15～20KHz 的超声波在高强度声能输入下可以进行细
胞破碎；
⑷.冻融法：利用细胞内冰粒的形成和细胞液浓度的增高引起溶胀，通过冰粒的
迅速形成和消失使细胞结构破坏，从而达到使细胞内容物释放的目的；
⑸.化学方法：某些有机溶剂(如苯、甲苯)、抗生素、表面活性剂、金属螯合剂、
变性剂等化学药品都可改变细胞壁或膜的通透性从而使内容物有选择地渗透出来 ；
⑹.生物方法：如酶溶法，是用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法。常用的
溶酶有溶菌酶、蛋白酶等[17]。
1.2.4.2 ADH 纯化方法
细胞破碎后，从细胞中释放出的可溶性物质成分复杂，在分离纯化过程中需要利
用待分离酶蛋白与混合物中其它蛋白质之间在性质上的差异，设计出一组合理而有效
的分离纯化步骤。可作为分离纯化依据的蛋白质性质包括：蛋白质的大小、形状、电
荷、等电点、电荷分布、疏水性、溶解度、密度、配体结合能力、金属结合能力、可
逆性缔合、翻译后修饰、特异性序列或结构，以及非寻常性质如特殊的热稳定性、特
殊的抗蛋白酶解抗性、基因工程构建的纯化标记等。
醇脱氢酶的纯化一般分为三大步骤：首先从细胞中提取粗酶，将目的酶尽可能抽
提出来溶解于水相中，通过饱和硫酸铵沉淀盐析，有机溶剂等沉淀法初级分离；其次，
利用各种色谱层析法除去大多杂蛋白，得到较纯的酶；最后利用电泳方法进一步纯化
或作为目的产品纯度的鉴定[16,17]。
1.2.4.3 ADH 提取纯化的难点
在分离纯化过程中，酶的活力常常会受到影响，另外空气氧化、金属离子抑制等
因素也会影响酶的稳定性。如何文持酶的稳定性，阻止或减缓酶的失活，在分离纯化
过程中是必须考虑的问题。国内外科学工作者为从微生物细胞中提取出高活性的ADH
做了大量的探索。如M.C. Madhusudhan[18]
等人报道了用涉及沉淀和双水相萃取的集成
过程从面包酵母中提取和纯化醇脱氢酶，并进行了较深入地研究。黄淑芳[19]
等人对吸
附法和溶胶-凝胶法固定化醇脱氢酶进行了研究。
1.3 本课题的主要研究内容与研究意义
1.3.1 主要研究内容
本课题围绕“醇脱氢酶的提取与纯化”，主要开展了以下几方面的研究：
⑴．产苯乙醇脱氢酶菌株的筛选。从以苯乙醇为唯一碳源的培养基上筛选出产较
高活性的苯乙醇脱氢酶的菌株，并对菌株进行鉴定，为下一步醇脱氢酶的提取与纯化
做准备。
⑵．苯乙醇脱氢酶的制备。从筛选得到的目的菌株中提取醇脱氢酶，对醇脱氢酶
的提取纯化方法进行研究，并对影响提取纯化的因素进行考察，以得到纯度高、活性
高的 ADH，为醇脱氢酶的继续研究提供新的思路和方法。 ⑶．苯乙醇脱氢酶酶学性质的研究。对分离纯化得到的苯乙醇脱氢酶的酶学性质
进行研究，分别从蛋白质含量、最适反应温度、热稳定性、最适反应 pH、pH 耐受性
等方面考察酶学性质，为醇脱氢酶的进一步研究提供依据。