3.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳 17

3.5.1 染色和脱色 17

3.6 弹性蛋白酶酶活力的测定 17

4 结果与讨论 18

4.1 突变蛋白的N-糖基化修饰水平 18

4.2 N-糖基化修饰位点类型的改变对表达量的影响 19

结论 21

参考文献 22

致 谢 26

附 录:作者在本科期间发表的论文网清单 27

 引言：

1.弹性蛋白酶简介

铜绿假单胞菌弹性蛋白酶（EC 3.4.24.26），中文简称弹性蛋白酶，其英文术语为Pseudomonas aeruginosa elastase（简称PAE）。该蛋白酶属于蛋白酶M4家族，即嗜热菌蛋白酶家族（thermolysin family）。它是由铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）产生的一种用来水解不溶性弹性蛋白为主要特性的锌金属蛋白酶[1-4]。

铜绿假单胞菌弹性蛋白酶是通过lasB基因表达，该基因的编码区全长1497bp,编码的为53.7kDa分子量的多肽（498个氨基酸残基，prepropseudolysin），其中1-23位氨基酸残基多肽为分子量2.4kDa的信号肽（signal peptide），24-197位氨基酸残基多肽为分子量18.2kDa的前导肽（propeptide），最后198-498位氨基酸残基多肽为分子量33.1 kDa的成熟蛋白酶（mature protease）[1,2,5]。未剪切前的信号肽、前导肽以及成熟蛋白酶的多肽称为前弹性蛋白酶原（prepropseudolysin），其中在未自我剪切成熟前的前导肽和成熟蛋白酶多肽称为弹性蛋白酶原（propseudolysin）。

弹性蛋白酶的分子量为33.1kDa，等电点为5.88，其适宜温度为60℃，在不高于60℃条件下很稳定，最适宜pH为8.0，在pH5.0-10.0条件下稳定[6,7]。该蛋白酶能高效水解以Leu或Phe等疏水氨基酸残基为羧基端的肽键，另外该酶具有较为广泛的蛋白底物降解范围，其中酪蛋白、卵白蛋白、胶原蛋白、牛血清白蛋白、明胶都能被其降解[8,9]。

弹性蛋白酶在实际生活生产中有很高的应用价值，尤其在降解羽毛蛋白资源、食品深加工以及在有机溶剂中催化合成肽方面发挥着良好作用[15,16]。在降解羽毛方面：90%的羽毛是蛋白质，其中主要是β-角蛋白，由二硫键、氢键和疏水键高度交联形成的纤维化而不可溶的一种结构[10-12]。因为它的结构致密性，羽毛角蛋白化学性质结构稳定，不会被正常常见的蛋白酶，比如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等水解[11,13]。全球家禽养殖业每年产生超过5亿吨的废弃羽毛对环境造成了一定的危害[14]。而由铜绿假单胞菌产生的弹性蛋白酶（也有文献称其为角蛋白酶）具有良好的降解羽毛蛋白的能力[15]；在农副产品深加工领域：弹性蛋白酶能够水解动物组织中一些难以处理的蛋白，还能有效的降解结缔组织中坚韧的弹性纤维部分达到嫩化肉质但不改变原有风的效果，可以在食品工业中作为优秀的肉类嫩化剂[17]；在有机溶剂中催化合成肽方面：有机溶剂能够改变蛋白酶催化反应的平衡，可导致肽的合成而且还改变了酶的底物特异性。这些特性为合成多肽提供了新的方法[18]。利用蛋白酶在有机溶剂中催化多肽的合成这项技术有许多优势也有限制因素（酶在有机溶剂中的稳定性普遍不高，而且酶的活性与在水相中相比也要差），因此，获得在有机溶剂中稳定且活性好的蛋白酶是这项技术的关键[19,20]。

2.弹性蛋白酶基因的异源表达