酵母Pim1蛋白酶对HSP60蛋白的降解(2)
1. 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌株
本实验所用的安琪甜酒曲购于湖北宜昌安琪酵母有限公司，其他实验药品均来自周口师范学院生命科学系分子生物学实验室。
1.1.2 培养基和缓冲液
活化,初筛培养基(定容至 500 ml ):
成分 质量
酵母膏 5 g
蛋白胨 10 g
琼脂粉 10 g
无水葡萄糖 10 g
扩大培养基(定容至 300 ml )：
成分 质量
酵母膏 3 g
蛋白胨 6 g
无水葡萄糖 6 g
破壁缓冲液（0.1 mol/L, PH 7.4, 定容1000 ml）：
成分 质量
NaH2PO4 3.12 g
Na2HPO4 35.8 g
取NaH2PO4 3.12 g溶于100 ml水中；取Na2HPO4 35.8 g溶于500 ml水中；取95 ml NaH2PO4溶液，405 ml Na2HPO4溶液混合在一起，定容至1000 ml。
凝胶贮备液（定容至100 ml , 外包锡纸, 4 ℃冰箱保存）：
成分 质量
丙烯酰胺（Acr） 29.2 g
亚甲基双丙烯酰胺（Bis） 0.8 g
分离胶缓冲液(定容至100 ml , PH 8.8 , 4 ℃冰箱保存)
1.5 mol/L三羟甲基氨基甲烷 (Tris) - HCl，18.15g Tris，加约80 ml重蒸水。
浓缩胶缓冲液：(定容至100 ml , PH 6.8 , 4 ℃冰箱保存)
0.5 mol/L Tris-HCl，6gTris，加约60 ml重蒸水。
10%十二烷基磺酸钠（SDS）室温保存。
质量浓度为10%的过硫酸铵：此溶液需临用前配置。
12%的分离胶：
成分 体积
重蒸水 3.35 ml
分离胶缓冲液 2.5 ml
10%SDS 0.1 ml
凝胶贮备液 4.0 ml
10%过硫酸铵 50μl
TEMED 5μl
总体积 10 ml
15%的分离胶：
成分 体积
重蒸水 2.35 ml
分离胶缓冲液 2.5 ml
10%SDS 0.1 ml
凝胶贮备液 5.0 ml
10%过硫酸铵 50μl
TEMED 5μl
总体积 10 ml
5%的浓缩胶：
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