能和Taq DNA聚合酶作用的蛋白质的筛选(2)
This paper has already worked out the experimental operation process to how to purify the protein which is attached with the Taq DNA polymerase protein. Even more ,some guess and assume are pointed out to solve some foundational question.
Key words: PCR, Taq DNA polymerase, Streptavidin column, SDS-PAGE
目录
一、绪论 - 1 -
1.1、PCR - 1 -
1．2、Taq DNA聚合酶 - 2 -
1.3、热启动 - 2 -
1.4常用蛋白标签 - 2 -
1.5、琼脂糖凝胶电泳 - 3 -
1.6、聚丙烯酰氨凝胶电泳 - 4 -
二、实验主要操作流程 - 6 -
2.1培养Taq DNA聚合酶工程菌pET29a-Taq-Avitag 菌株：Rosetta 高温菌：Thermus themphilus 常温菌:E.coli DH5a - 6 -
2.1.1、培养基及试剂 - 6 -
2.1.2试管培养 - 7 -
2.1.3摇瓶培养 - 7 -
2.2、 Taq DNA聚合酶的初步提取 - 7 -
2.3、用链霉亲和柱提纯标签蛋白 - 8 -
2.4. 检测Taq DNA聚合酶活性 - 9 -
2.5.利用琼脂糖凝胶电泳检测其它蛋白质存在 - 10 -
三、实验结论和结果探究 - 13 -
四.实验展望 - 15 -
致 谢 - 16 -
参考文献 - 17 -
一、绪论
1.1、PCR
PCR技术聚合酶链式反应英文全称(Polymerase Chain Reaction），简称PCR。聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，有高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用与基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）又用于无细胞子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。20世纪50年代分子生物学创立，在近60年的时间里，其理论与技术己渗透到生命科学的各个领域，极大促进了原有学科的发展，同时也派生出许多新的学科。如今，以分子生物学为核心的生物技术与微电子技术一起已成为21世纪的支柱产业。而作为生物工程产物的聚合酶链式反应技术的问世，又使分子生物学方法实现了惊人的转变，它己成为DNA实验室不可或缺的组成部分，正在现代分子生物学及与之相关的研究中发挥着重要作用。
聚合酶链式反应（PCR）扩增基因的过程，类似于体内DNA复制的过程。其基本原理是在DNA模板、寡核苷酸引物、4种dNTPs和耐热性DNA聚合酶存在的条件下，以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动，沿模板5'→3'方向延伸，根据碱基互补配对原则特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。每一循环包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此循环30次，介于两个引物之间的新生DNA片段理论上达到230拷贝（约为109个分子）。寡核苷酸引物和模板DNA结合的特异性决定着PCR技术的特异性。PCR反应中，在PCR体系中加入耐热性DNA聚合酶、dNTPs与模板后，通过温度变化调控反应进程。双链DNA经过高温变性（heat denaturation）、引物退火（primer annealing）和延伸（primer extension）三步反应反复循环而完成目标DNA的扩增。
1．2、Taq DNA聚合酶
Taq聚合酶是一种耐热的DNA聚合酶，由于发现于水生栖热菌（Thermus aquaticus）内，故命名为Taq聚合酶（Taq polymerase），也称为Taq DNA聚合酶，简称Taq酶或Taq。Taq聚合酶常见于PCR技术，用于大量扩增DNA片段。Taq DNA聚合酶具有以下特点：①耐高温，Taq DNA酶在70℃高温下反应2h后其活性保持原来的90%以上，在93℃下热处理2h后其活性保持为原来的60%以上，95℃时酶活性半衰期为1.5h。②热稳定性。在热变性时酶活性不会被钝化，因此不必在每次PCR反应后另加新酶。③较高的扩增效率、灵敏度和特异性。