CA测定试剂：

KMnO4(50.0 g l-1)-NaBr (50.0 g l-1)溶液：称取5.0 g KMnO4和5.0 g NaBr溶于80.0 ml的蒸馏水中定容至100.0 ml。

四硼酸钠(20.0 g l-1)-硫脲(40.0 g l-1)溶液：称取4.0g的硫脲溶于80.0 ml蒸馏水中，再称取2.0 g硼酸钠溶于其中，定容至100.0 ml。

过氧化氢(30.0 g l-1)：称取10.0 ml的30%的过氧化氢溶液，用蒸馏水定容至100.0 ml。文献综述

HPO3溶液(100.0 g l-1)：5.0 g的HPO3溶于50.0 ml的稀释硫酸溶液中（H2SO4：H2O=1：4)。

葡萄糖浓度测定试剂：

DNS：分别称取19.8 g NaOH及10.6 g 3, 5-二硝基水杨酸（DNS）在1416.0 ml的 蒸馏水中溶解后，加酒石酸钾钠306.0 g、苯酚7.6 ml（56 ℃提前融化）及偏重亚硫酸钠8.3 g。

2.2实验方法

2.2.1种子液的培养

Y. lipolytcia SWJ-1b细胞保存在4°C的YPD琼脂斜面培养基上。每月一次转移到新鲜的斜面以保持菌株活力。Y. lipolytcia SWJ-1b接种于5.0 ml的YPD液体培养基中。28℃、180 rpm培养24 h，取1.0 ml培养液（OD600 = 30）接种到50.0 ml CA发酵培养基。

2.2.2氧载体的筛选及发酵优化

在摇瓶中进行Y. lipolyt cia SWJ-1b的CA发酵实验，从大豆油、正庚烷、正己烷、十六烷、油酸和乙酸乙酯中筛选最适宜的氧载体。这些疏水物质通过0.22 μm无菌滤膜过滤后，添加至冷却的灭菌CA发酵培养基中。在氧载体筛选实验中，上述疏水物质分别被添加到CA培养基中，添加量为2%，而后进行发酵培养，并在发酵结束后，通过比较柠檬酸产量筛选最适氧载体。在油酸浓度的优化实验，不同浓度的油酸（1-5%）分别在发酵前添加到CA发酵培养基中，发酵结束测定CA产量。在油酸添加时间优化实验中，分别在不同的发酵时间将油酸添加到培养基中。CA发酵统一在28°C，180 rpm下进行。在发酵培养期间，根据溴甲酚紫的颜色变化，每隔一定培养时间滴加2.0 M的KOH溶液，将发酵pH值保持在6.0左右，直至pH不再变化作为发酵终点，发酵期间定期取样测定。

 CA发酵实验最后在5 L发酵罐中进行扩大培养。发酵罐装有碱泵、氧传感器、搅拌器、加热元件和温度传感器等。种子液的准备如上所述。60.0 ml的种子培养液（OD600= 30.0）接种至3.0 l发酵培养基中（油酸含量为1%，v/v）。发酵条件为：250 rpm的转速，充气率为3.0 l min-1 l-1培养基，温度28°C。每隔24 h采集20.0 ml进行产量测定，直到发酵培养基的pH恒定。

2.2.3 细胞干重和油脂含量的测定来!自-优.尔,论:文+网www.youerw.com

取上述发酵液10 ml，在5,000 × g、4°C条件下离心，去除上清液，洗涤菌体三次，放入80°C烘箱至恒重，称量细胞干重，然后计算每升细胞培养液的细胞干重。根据Folch et al.的方法，采用索氏提取法提取胞内油脂，方法如下：

将菌体用研钵磨碎，称量后用滤纸包好，再烘至恒重，记录样品包质量M。将索氏抽提瓶洗干净，用蒸馏水冲洗后烘至恒重，记录下抽提瓶质量M1。将索氏提取器安装好，将样品包置于抽提管中，并在管内注入无水乙醚至虹吸口以上，待虹吸完全之后再加至浸没样品包。冷凝管口用脱脂棉塞好，控制冷凝速度保持每小时回流6~8次，水浴温度55 ºC，回流8~10 h。无水乙醚回收，取下提取器，将抽提瓶置于80 ºC烘箱烘至残留的乙醚挥发干净，并烘干至恒重，记录含油脂的抽提瓶质量M2，M2-M1即为抽提的油脂质量，计算菌体油脂含量。