表1： 本实验所用引物信息

Primer Sequence

338F CCT ACG GGA GGC AGC AG

518R ATT ACC GCG GCT GCT GG

GC338F CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGGCGGGGCGGGGGCGCGGGGGG

CCT ACG GGA GGC AGC AG

PCR扩增体系（50 μL）为：10× PCR buffer 5 μL；dNTP（2。5 mM）3。2 μL；rTaq（5 U/μL）0。4 μL；GC-338F（20 μM）1 μL；518R（20 μM）1 μL；模板DNA 50 ng；补ddH2O至50 μL。

PCR扩增程序为：94℃预变性5 min； 94℃变性1 min， 55℃复性45 s，72℃延伸1 min， 30个循环；最终72℃延伸10 min。

PCR产物采用OMEGA公司DNA Gel Extraction Kit纯化回收。

PCR仪为Biometra公司生产的T-gradient，凝胶成像仪为Bio-Rad公司的Gel-Doc2000凝胶成像系统。

2。3。3 PCR产物的变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析

取10 μL PCR的产物进行变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析。采用变性梯度为35%～55%、浓度为7%的聚丙烯酰胺凝胶在1×TAE缓冲液中56V 60℃下电泳14小时。

变性梯度凝胶电泳（DGGE）完毕后、采用银染法染色、步骤如下：

固定液（乙醇 50 mL、冰醋酸2。5 mL、定容500 mL）固定15 min

Milli-Q纯水清洗、20 s和2 min各一次来*自-优=尔,论:文+网www.youerw.com

银染液（硝酸银1 g、37%甲醛0。75 mL、定容500 mL）染色15 min

Milli-Q纯水清洗、20 s和2 min各一次

显色液（氢氧化钠7。5 g、37%甲醛2。5 mL、定容500 mL）显色5-7 min

最后用终止液（乙醇50 mL、冰醋酸2。5 mL、定容500 mL）终止反应

2。3。4 DGGE图谱中优势条带的回收与测序

用灭菌的手术刀切下待回收DGGE条带，采用OMEGA 公司Poly-Gel DNA Extraction Kit回收目的条带。

以2 μL回收产物为模板，338F/518R为引物进行PCR扩增。

PCR扩增体系（50 μL）为：10× PCR buffer 5 μL；dNTP（2。5 mM）3。2 μL；rTaq（5 U/μL）0。4 μL；338F（20 mM）1 μL；518R（20 mM）1 μL；模板DNA 1 μL；补ddH2O至50 μL。

PCR扩增程序为：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，55℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；最后，72℃延伸10 min。

将重新扩增的DNA片段切胶回收、纯化后，连接到Pmd18-T载体上，并转化至DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，进行序列测定。