黄豆萌发过程中营养物质的动态变化研究(2)
1.实验部分
1.1 实验所用仪器及试剂
材料：大豆（巨丰1号）。
试剂及药品：氯化汞、氯化钠、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G250、无水乙醇、磷酸、蒽酮、浓硫酸、葡萄糖、碘、碘化钾、抗坏血酸、草酸、邻菲啰啉、柠檬酸三钠、盐酸羟胺、浓盐酸、氨水、醋酸钠、冰醋酸、硫酸亚铁铵、芦丁、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等均为分析纯。
实验仪器：UV-5100型紫外可见分光光度计（上海棱光技术有限公司）；AL204型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；SAB-Ⅲ型循环水式真空泵（郑州欧卡仪器设备有限公司）；HWS24型电热恒温水浴锅（上海-恒科学仪器有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（上海-恒科学仪器有限公司）；双铁皮电炉（上海达富有限公司）；PHS-25型PH计（上海精密科学仪器有限公司）；LRHS-150B恒温恒湿培养箱（常州诺基仪器有限公司）。
1.2 发芽大豆的实验室制备
大豆处于贮藏期，大豆自身中的酶都处于休眠状态，Kurkdjian和Guern的报道证实，本文来自优尔\文+论~文?网，毕业论文 www.youerw.com大豆浸泡处于低氧条件，可以使大豆体内休眠的酶激活[3]。所以，挑选成熟饱满未有破损的种子用0.1%氯化汞消毒处理3 min，而后用蒸馏水洗4次，用5倍的水浸泡过夜(W / V ) 。浸泡的种子用自来水完全冲洗一遍, 然后铺放在表面含有三层纱布的12个培养皿中，用记号笔标上发芽时间分别为12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h做两个平行，每个培养皿中放50粒种子，培养皿中放自来水，使种子底部正好浸湿于水面。种子表面也用纱布盖上以避光，放在恒温28℃的培养箱中进行培养[4]。发芽时每12 h浇淋种子一次。将发芽时间到了的种子取出，数一下发芽种子的粒数，将其与种子的总粒数进行比值得出发芽率。然后，用直尺测量发芽种子的芽长，求出其平均值，即为芽长。再将发芽好了的种子称其湿重后，立即放在40 ℃烘箱中烘干10 h后取出称其干重。将种子用粉碎机粉碎过60目筛子。将粉好后的大豆粉样品放入小烧杯中待用。由于文生素C易氧化，要用新鲜研磨的方法进行测定[5-7]。所以，本实验，另外培养50粒黄豆种子用于文生素C的测定。
1.3 样品液中可溶性蛋白质含量测定
采用考马斯亮蓝结合法，原理：考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465 nm，当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，在595 nm有最大吸收峰，此复合物的吸光度和蛋白质的含量呈线性关系，可用于蛋白质浓度的测定。
1.3.1试剂配制
标准蛋白液：牛血清白蛋白（0.1 mg/mL），准确称取牛血清白蛋白0.2 g，用0.9%NaCl溶液溶解并稀释至2000 mL。
染液：考马斯亮蓝G250（0.01%），称取0.1 g考马斯亮蓝G250溶于50 mL 95%乙醇中，再加入100 mL85%磷酸，加蒸馏水定容至1000 mL。
1.3.2可溶性蛋白质标准曲线的制备[8]
取7支干净试管，按下表进行编号并加入试剂。加完混匀，室温静置3 min，以第一管为空白，于波长595 nm处比色，读取吸光度。以吸光度为纵坐标，各标准液浓度（μg/mL）作为横坐标，作图得标准曲线。
表1 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度—标准曲线的制备
1 2 3 4 5 6 7
标准蛋白液/mL 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8
0.9%NaCl/mL 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.4 0.2
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