1.实验部分
1.1 实验所用仪器及试剂
材料:大豆(巨丰1号)。
试剂及药品:氯化汞、氯化钠、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G250、无水乙醇、磷酸、蒽酮、浓硫酸、葡萄糖、碘、碘化钾、抗坏血酸、草酸、邻菲啰啉、柠檬酸三钠、盐酸羟胺、浓盐酸、氨水、醋酸钠、冰醋酸、硫酸亚铁铵、芦丁、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等均为分析纯。
实验仪器:UV-5100型紫外可见分光光度计(上海棱光技术有限公司);AL204型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司);SAB-Ⅲ型循环水式真空泵(郑州欧卡仪器设备有限公司);HWS24型电热恒温水浴锅(上海-恒科学仪器有限公司);电热恒温鼓风干燥箱(上海-恒科学仪器有限公司);双铁皮电炉(上海达富有限公司);PHS-25型PH计(上海精密科学仪器有限公司);LRHS-150B恒温恒湿培养箱(常州诺基仪器有限公司)。
1.2 发芽大豆的实验室制备
大豆处于贮藏期,大豆自身中的酶都处于休眠状态,Kurkdjian和Guern的报道证实,本文来自优尔\文+论~文?网,毕业论文 www.youerw.com大豆浸泡处于低氧条件,可以使大豆体内休眠的酶激活[3]。所以,挑选成熟饱满未有破损的种子用0.1%氯化汞消毒处理3 min,而后用蒸馏水洗4次,用5倍的水浸泡过夜(W / V ) 。浸泡的种子用自来水完全冲洗一遍, 然后铺放在表面含有三层纱布的12个培养皿中,用记号笔标上发芽时间分别为12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h做两个平行,每个培养皿中放50粒种子,培养皿中放自来水,使种子底部正好浸湿于水面。种子表面也用纱布盖上以避光,放在恒温28℃的培养箱中进行培养[4]。发芽时每12 h浇淋种子一次。将发芽时间到了的种子取出,数一下发芽种子的粒数,将其与种子的总粒数进行比值得出发芽率。然后,用直尺测量发芽种子的芽长,求出其平均值,即为芽长。再将发芽好了的种子称其湿重后,立即放在40 ℃烘箱中烘干10 h后取出称其干重。将种子用粉碎机粉碎过60目筛子。将粉好后的大豆粉样品放入小烧杯中待用。由于文生素C易氧化,要用新鲜研磨的方法进行测定[5-7]。所以,本实验,另外培养50粒黄豆种子用于文生素C的测定。
1.3 样品液中可溶性蛋白质含量测定
采用考马斯亮蓝结合法,原理:考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色,最大吸收峰在465 nm,当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色,在595 nm有最大吸收峰,此复合物的吸光度和蛋白质的含量呈线性关系,可用于蛋白质浓度的测定。
1.3.1试剂配制
标准蛋白液:牛血清白蛋白(0.1 mg/mL),准确称取牛血清白蛋白0.2 g,用0.9%NaCl溶液溶解并稀释至2000 mL。
    染液:考马斯亮蓝G250(0.01%),称取0.1 g考马斯亮蓝G250溶于50 mL 95%乙醇中,再加入100 mL85%磷酸,加蒸馏水定容至1000 mL。
1.3.2可溶性蛋白质标准曲线的制备[8]
取7支干净试管,按下表进行编号并加入试剂。加完混匀,室温静置3 min,以第一管为空白,于波长595 nm处比色,读取吸光度。以吸光度为纵坐标,各标准液浓度(μg/mL)作为横坐标,作图得标准曲线。
表1 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度—标准曲线的制备
    1    2    3    4    5    6    7
标准蛋白液/mL     0    0.1    0.2    0.3    0.4    0.6    0.8
0.9%NaCl/mL    1.0    0.9    0.8    0.7    0.6    0.4    0.2
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