3。2 degQ基因的克隆 11

3。3连接pEASY-T1-degQ的验证 11

3。4质粒pEASY-T1-degQ和质粒pNZ8149的双酶切 11

3。5 pNZ8149-degQ的转化 12

3。6连接pNZ8149-degQ验证 13

4。讨论 13

参考文献 14

1。引言

食用甲鱼，学名中华鳖(Pelodiscus sinensis)，俗称团鱼、水鱼、王八、神守等，属于爬行纲(Reptilia)、龟鳖目(Chelonia)、鳖科(Trlonychidae)、鳖属(Trionyx)[1]，是我国重要的特种淡水养殖动物，具有较高的食用和药用价值。现今由于野生食用甲鱼资源减少，集约化加温养殖方式飞速发展，但是在加温条件下，食用甲鱼的生态习惯和生长规律被人为改变，温室内温度比较高，水质恶化比较快，微生物繁殖也随之加速，导致食用甲鱼的发病率、死亡率大大增加。如今，食用甲鱼疾病主要有细菌病、真菌病、寄生虫病和病毒病，其中细菌性疾病危害最大，尤以嗜水气单胞菌病最为突出。

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是气单胞菌的模式种，没有芽胞和荚膜[2]，对水产动物、畜禽以及人类均有致病性，可引起多种水产动物的败血症[3]和人类腹泻[4]。在嗜水气单胞菌的感染和致病过程中有多种例如粘附因子、外毒素、蛋白酶等因子相互作用[5]。食用甲鱼嗜水气单胞菌感染的主要症状及病理表现为：食欲减退；对外界反应的敏感性降低；腹甲充血或失血；肝脏发黑、肿大；心、肾呈现炎症，脾淤血、肿大；口腔粘膜呈弥散性出血，肠胃粘膜出血等。这对食用甲鱼的生长繁殖造成了很大的影响，预防嗜水气单胞菌的感染成为食用甲鱼养殖过程中非常重要的一个环节。

在现有条件的嗜水气单胞菌预防过程中，抗生素由于其抗药性治疗效果并不显著[6]，而对于嗜水气单胞菌疫苗的研究显现了越来越好的前景，尤其是口服疫苗的制备，它不仅能获得向食用甲鱼注射常规疫苗的免疫效果，还能防止疫苗被胃酸和胃蛋白酶破坏情况的发生，提升免疫效果。论文网

乳酸菌常常在食品发酵和食品保存过程中发挥作用，它安全无毒，能够促进机体健康，同时用来表达的外源蛋白甚至可以无需经过纯化就直接连通菌体一起服用。由于乳酸菌外源基因容量比较大，刺激细胞免疫力强，可以诱导产生大量的细胞因子，在基因工程疫苗载体研究中占据重要地位[8]，乳酸菌口服疫苗的研究制作成为热点。乳酸菌活载体疫苗是以乳酸菌为载体菌，通过基因工程技术重组病毒、细菌或寄生虫等病原基因，构建能表达外源抗原或携带外源DNA疫苗的重组乳酸菌。

丝氨酸蛋白酶是一类以丝氨酸为活性中心的重要的蛋白水解酶，在生物有机体中起着重要而广泛的生理作用[8-9]，它们通过对蛋白酶原的激活或抑制而起调节因子作用。目前，在丝氨酸蛋白酶细菌表达系统中，E。 coli是最常用的革兰氏阴性宿主菌。本研究通过对高毒力的嗜水气单胞菌和低毒力的嗜水气单胞菌的蛋白质组测序分析[10]，得到差异基因，利用PCR扩增技术得到degQ基因序列,再将其克隆到食品级乳酸菌诱导表达载体pNZ8149中,最终转化得到基因工程载体pNZ8149-degQ。

2。材料与方法

2。1材料与试剂

2。1。1菌株与质粒

嗜水气单胞菌TL1分离自浙江杭州的某中华鳖养殖场的一只患病的中华鳖肝脏， TL1是degQ的来源菌，以上菌株由实验室-80 °C保存。pEASY-T1（AmpR）为degQ基因序列PCR产物的载体，购自北京全式金生物技术有限公司，pNZ8149是乳酸菌诱导表达载体，由实验室构建。