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    1.3  试验方法
    1.3.1  γ辐照处理    称取猪肉过敏原PSA标准品500 mg,然后加入100 mL去离子水使之均匀混合,后用尼龙真空袋将其密封包装。然后在10±0.5℃条件下立即进行60Co-γ辐照处理,辐照剂量分别设定为1、3、5、7、10 kGy 6个水平,另设0 kGy为对照组。最后迅速将经辐照处理的样品冻干备用。
    1.3.2  SPR方法的建立    (1)SPR生物传感器芯片制备:室温条件下,将CM5芯片浸泡于刚制备的洗液中浸泡10 min,浸泡过程中需震荡3~5次以除去芯片表面的气泡,取出后用大量去离子水冲洗,并用洗耳球吹干。整个实验过程流速设定为10 μL/min。首先将CM5芯片置于Biacore™ T200生物传感器中,待基线平稳后,依次进行以下步骤:①将50 μL 0.4 mol/L EDC和50 μL 0.1 mol/L NHS混合均匀,然后取70 μL混合物用于活化芯片;②加入100 μL 100 μg/mL羊抗PSA IgG抗体[用0.01 mmol/L PBS缓冲液(pH7.4)配制];③用100 μL 1 mol/L盐酸乙醇胺封闭未结合抗体的位点。由以上步骤制得的芯片可直接用于检测猪肉过敏原PSA。(2)样品检测:整个实验中进样流速设为10 μL/min,检测时待测液体积为50 μL。先通入含0.05%Tween-20的0.01 mmol/L pH 7.4 PBST缓冲液,待基线稳定后通入待测样品。所得试验数据需扣除缓冲溶液背景值,所有待测样品及空白对照均检测3次。(3)芯片再生:为提高CM5生物传感器芯片的使用率,将Gly-HCl再生液以10 μL/min的流速注入检测过样品的芯片中,持续30 s,使之再生,进行抗原抗体的解离。
    1.3.3  致敏性测定    先用0.01 mmol/L PBS缓冲液(pH7.4)将待测样品分别稀释至400、200、100、50、25 nmol/L 5个浓度梯度,然后以10 mmol/L Gly-HCl(pH1.5)作为再生液,将反应温度设定为25℃,采用Biacore™ T200控制软件中的动力学分析Wizard模板进行动力学试验。参照1.4.2方法,分别测定不同剂量的60Co-γ辐照处理后猪肉过敏原PSA与抗体相互作用的动力学反应,以此观察过敏原的致敏性变化情况。根据Biacore™ T200分析软件进行拟合,以时间为横坐标,响应值为纵坐标,计算抗原抗体的结合常数(ka)和解离常数(kd),然后通过kd/ka计算得出平衡解离常数(KD)[28]。抗原抗体间的固有结合力,即抗体的亲和力,可用KD值表示,其值越大,表明抗体与抗原的结合越弱。
    1.3.4  CD光谱分析    在25±1℃条件下,分别将待测样品溶于0.01 mmol/L PBS的缓冲液(pH7.4)中,最后的蛋白浓度为0.05 mg/mL。测试条件:将扫描波长范围设为190~260 nm,扫描速度设为1 nm/s,光谱狭缝带宽设为1 nm。CD数据用CDNN2.1软件计算,累计扫描3次CD光谱,取平均值作为试验结果,并扫描缓冲液,扣除缓冲液信号,氨基酸残基的平均分子量按583计算。
    1.3.5  紫外光谱分析    在25±1℃条件下,分别将待测样品溶于10 mmol/L PBS的缓冲液(pH7.4)中,最后的蛋白浓度为0.5 mg/mL。测试条件:扫描波长范围设为220~350 nm,扫描速度设为240 nm/min,光谱狭缝带宽设为1 nm,重复扫描3次紫外光谱后取平均值。
    1.3.6  荧光光谱分析    在25±1℃条件下,分别将待测样品溶于10 mmol/L PBS的缓冲液(pH7.4)中,最后的蛋白浓度为0.05 mg/mL。测试条件:发射波长设为300~550 nm,激发波长设为295 nm,扫描速度设为1200 nm/min,光谱狭缝带宽设为10 nm,重复扫描3次荧光光谱后取平均值。
    1.3.7  数据分析    方差分析(analysis of variance,ANOVA)使用SPSS17.0软件,采用0.05水平。绘图使用Microcal Origin 7.5软件(美国Microcal Software 公司)
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