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摘要：目前，耐药基因作为一种新型的环境污染物被越来越多地关注，四环素耐药基因是其中重要的一类，因此对四环素耐药机制的研究有着重要的意义。本课题利用在珠穆朗玛峰土壤宏基因组文库中筛选出的四环素抗性基因MQTet1435进行克隆、异源表达蛋白并纯化，并检测纯化蛋白的体外活性，结果表明MQTet1435是一种新的四环素抗性基因，编码四环素解构酶MQTet1435，该酶通过改变四环素的化学结构使四环素失去药性。33196
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毕业论文关键词：宏基因组文库；四环素耐药机制；四环素解构酶；异源表达
Heterologous Expression and Functional Analysis of Tetracycline Destructase
Abstract: As one of novel environmental pollutions, anti-tetracycline genes is getting more and more concerning nowadays, which means that there is a big significance studying the mechanisms of tetracycline antibiotic resistance. This research has cloned one tetracycline antibiotic resistance gene MQTet1435, which is discovered from metagenome of Qomolangma soil, heterologous expressed and purified the target protein. The result of experiment in vitro preliminarily indicated that gene MQTet1435 is a novel tetracycline antibiotic resistance gene, encoding tetracycline destructase MQTet1435. This enzyme changes the structure of tetracycline, so that tetracycline does not work any more. Apparently, this research laid the foundation for further study in mechanisms of the new enzyme.
Keywords: antibiotic resistance genes; mechanisms of anti-tetracycline; tetracycline destructases; heterologous expression
目 录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 菌株来源2
1.1.2 引物设计2
1.1.3 主要仪器和设备2
1.1.4 主要试剂、培养基和溶液3
1.2 方法3
1.2.1 PCR引物设计与合成3
1.2.2 MQTet1435阳性亚克隆质粒提取3
1.2.3 MQTet1435基因PCR扩增4
1.2.4 琼脂糖凝胶电泳4
1.2.5 琼脂糖凝胶DNA回收4
1.2.6 载体pET-30a和PCR产物双酶切5
1.2.7功能基因-表达载体重组子构建5
1.2.8功能基因-表达载体重组子脱盐5
1.2.9 功能基因-表达载体重组子电转化5
1.2.10原核重组子测序5
1.2.11 MQTet1435蛋白的原核表达5
1.2.12 MQTet1435蛋白的纯化6
1.2.13 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯化蛋白6
1.2.14 MQTet1435蛋白的体外活性实验6
2 结果与分析6
2.1 引物设计6
2.2 四环素解构酶基因MQTet1435的克隆7
2.3 MQTet1435蛋白的表达与纯化8
2.4 MQTet1435蛋白的体外功能活性实验9
3 讨论10
致谢11
参考文献11
图2-1 四环素解构酶MQTet1435与Tet49和TetX氨基酸序列比对7
图2-2 MQTet1435 PCR扩增产物8
图2-3 pET-30a(+)酶切胶回收产物8
图2-4 功能基因-表达载体重组子Nde I和Xho I酶切产物8
图2-5 诱导各阶段蛋白SDS-PAGE8
图2-6 反向HPLC分离四环素和酶分解产物（260nm）9
表1-1 引物名称及序列3
表1-2 PCR反应体系4
表1-3 载体pET-30a和PCR产物双酶切体系3
表1-4 功能基因-表达载体重组子构建连接体系3
表1-5 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳3
表2-1 特异性引物名称及序列3
四环素解构酶的异源表达与功能分析
四环素属于四环素类抗生素，是一种低毒、高效而又价格低廉的广谱抗生素。四环素能够通过细菌细胞膜进入细胞质，以阳离子—四环素复合物的形式特异性地与核糖体30S亚基上的A位点结合，阻止氨基酸与tRNA在该位点结合，从而抑制肽链的延伸和蛋白质的合成，影响细菌的正常生长，起到抑菌的作用。除了抑菌的优良效果，研究人员还发现了四环素的许多非抗生素作用，例如清除自由基、诊断恶性肿瘤等[1]。正是由于低廉而又高效的优点，四环素被广泛应用于临床医学及动物养殖。