1引言

Penicillium digitatum俗称绿霉，是果蔬采后主要病原菌之一，在环境中广泛存在，通过土壤、作物残骸、载具、污水等方式接触果实，一旦侵染果实伤口即可迅速发病。它不仅导致果实的腐烂，如引发柑橘绿霉病、苹果绿霉病等，降低果实的保存时间和商品价值，给果蔬产业带来极大的损害[1] [2]。目前，低温、杀菌剂、生防菌均可降低P。 digitatum的危害。提高储藏环境的卫生条件也可以有效的降低果实的腐烂率、腐烂程度以及毒素的积累。P。 digitatum属于嗜冷性真菌，孢子抗逆性强，耐低温；然而虽然化学杀菌剂能有效地控制采后P。 digitatum对柑橘的侵害，但是过量使用杀菌剂将导致化学物质的残留从而对人类的健康安全造成隐患[3] [4]，还会增加P。 digitatum对这些杀真菌剂的抗性产生抗性菌株，甚至导致P。 digitatum次级代谢的提高，引起毒素积累；同时生防菌成本昂贵，受环境条件影响较大。针对P。 digitatum发展新的贮藏保鲜方法及策略是非常必要的。论文网

真核生物基因组中编码核糖体的基因（5S、5。8S、18S、28S rDNA）在染色体上串联排列，相互之间由内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer, ITS）间隔。该间隔区进化相对迅速且具多态性，因而，基于rDNA-ITS多态性的序列分析，辅以传统的形态特征观察的方法，可以快速、准确的反映生物亲缘关系与分类情况，这种方法已经广泛应用于真菌属种间及部分种内组群水平的系统学研究[5] [6-7]。

近年来，一些能够用于果蔬采后病害的防治的无毒或低毒的有机化学物质陆续被发现，并展现出一定的应用前景。癸醛，一种天然存在于柑橘、柠檬、西红柿、草莓中的醛类，同时又存在于一些木本或草本香料中（如毛叶小芸木）[8] ，是一种有机原料，性质稳定，主要用途有以下三点：一是用于有机合成和作香料用；二是微量用做柑橘型头香及花香；三是用于食用香精。

但目前，已有不少实验结果表明癸醛在采后水果病害防治方面具有良好效果及可观的应用前景。癸醛可从植物精油中分离出来。例如，在研究七种柑橘精油组分（β-蒎烯、辛醛、芳樟醇、壬醛、α-松油醇、柠檬醛和癸醛）对P。 digitatum的影响中，数据表明癸醛可以抑制P。 digitatum[9]。在从甜橙精油中提取癸醛，芳樟醇，萜和辛醛测其生物活性的实验中，癸醛具有抗氧化活性及对微生物有抑制和杀灭作用[10]。从沙田柚和甜橙精油中提取癸醛等活性物质，表现出对寄生曲霉以及黑曲霉的抑制作用[11]。从蚤草属精油中提取其系列物质，能够抑制扩展青霉、葡枝根霉以及交链孢霉 [12] 。文献综述

因此，本研究从腐烂的柑橘中分离主要致病菌，利用rDNA-ITS法确定其遗传背景，并通过相关生理、生化指标测定以及果实接种实验，对癸醛与病原菌发育及致病力的关系进行了分析，实验结果为果蔬采后病原菌的防治拓展了思路，并提供了一定的理论依据。

2 材料与方法

2。1 菌株及主要试剂

实验所用病原菌P。 digitatum从自然发病的柑橘中分离得到。癸醛购自美国Sigma公司，PCR所需试剂购自日本TAKARA公司，其他主要试剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司，DNeasy Plant Mini Kit（Cat。 No。 69106）及Gel Extraction Kit（Cat。 No。 28706）购自德国Qiagen公司。柑橘果实购自当地市场。

2。2 rDNA-ITS法鉴定病原菌

利用75%的无水乙醇对发病柑橘果实进行消毒，风干后在病斑边缘去除果皮，切取面积为0。1 cm2左右的果肉置于PDA（potato dextrose agar）培养基上，25 ℃培养24 h后，在菌落边缘分离菌种，转移至新的PDA培养基上，室温培养两周，观察拍照后，用含有0。05%（v/v）Tween-20的无菌水收集孢子，经四层无菌纱布过滤后使用。将孢子悬浮液加入PDB（Potato Dextrose Broth）培养基中，调节终浓度为1。0×106 spores/mL，摇床振荡（25 oC, 200 rpm）培养24 h后收集菌丝。液氮研磨后使用DNeasy Plant Mini Kit（Cat。 No。 69106）提取病原菌基因组。利用真菌ITS通用引物（ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）进行PCR扩增（Gardes and Bruns, 1993）。PCR反应体系为ddH2O 18 µL、10×Buffer 2。5 µL、dNTP（2。5 mmol /L）1 µL、ITS1及ITS4（10 µmol /L）各1 µL、Taq酶（2。5 unit /µL）0。5 µL、模板DNA 1 µL。PCR反应参数：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、56℃ 1 min、72 ℃ 1 min，35个循环，72 ℃ 10 min。PCR产物进行琼脂糖（浓度为1%）凝胶电泳（120 v 恒电压，20 min），利用Gel Extraction Kit（Cat。 No。 28706）回收目的片段，送至上海英俊生物技术有限公司测序，结果在http://blast。ncbi。nlm。nih。gov /Blast。cgi中进行同源性分析，确定菌种类别。